基于磁性纳米粒子的粮油制品真伪鉴别技术研究

葛文亮， 王文彬， 胥传来

（1.无锡市第二人民医院，江苏 无锡214002；2.江南大学 食品学院，江苏 无锡214122）

基于磁性纳米粒子的粮油制品真伪鉴别技术研究

葛文亮1， 王文彬2， 胥传来2

（1.无锡市第二人民医院，江苏 无锡214002；2.江南大学 食品学院，江苏 无锡214122）

通过PCR检测食用油中内源性DNA是鉴定食用植物油品种真实属性，检测食用油掺假的一种有效方法。然而由于精炼的食用油中DNA含量极低，如何有效富集食用油中的DNA是实现PCR鉴别粮油的关键。因此，作者研究了磁珠法富集食用油中的DNA并通过实时荧光PCR检测芝麻油、菜籽油、稻米油的内源基因。结果表明经过5次乳化后和磁珠进一步富集水相中的DNA，实时荧光PCR成功检测到了食用油中的内源性基因，琼脂糖凝胶电泳分析进一步证明实现了上述3种食用植物油的定性鉴定。

磁珠；PCR；食用油；DNA提取

食用油脂是我国重要的粮油产品，也是居民不可缺少的营养品之一[1]。我国的食用植物油主要有大豆油、菜籽油、花生油、芝麻油、稻米油、棕榈油、橄榄油、茶油等。由于价格差异，近年来市场上食用油中如芝麻油、稻米油中常常出现掺假甚至造假的现象，给市场环境和消费者带来极大的负面影响。因此，建立主要粮油品种鉴定方法，实现掺假检测是十分必要的。

目前，气相色谱法[2-4]、紫外分光光度法[5]、红外光谱法[6]、拉曼光谱法[7]以及聚合酶链式反应法（PCR）[8-9]已被研究用于粮油掺假的检测。在这些方法中，PCR方法相对简便而且根据品种的保守基因不同设计引物，可以适用于所有食用油的鉴别[10]。而由于DNA本身易溶于水，经过水化、水洗等精炼过程后食用油中DNA的残留量很低[11]。因此，有效提取、富集食用油中的DNA是影响PCR成功鉴别粮油的关键。传统的DNA提取方法无法将食用油中低含量的DNA片段提取并用PCR检测到，而磁性纳米材料用于提取DNA的优势主要是自身粒径较小、比表面积大、分散性好，与DNA结合效率高，同时具有超顺磁性，操作简便、迅速[12-13]。目前磁珠多用于提取微生物等的基因组DNA，而用于提取粮油样品DNA的研究比较少。作者以多次乳化和磁珠富集为基础建立了粮油中DNA提取方法并通过实时荧光PCR成功鉴定了芝麻油、菜籽油、稻米油以及调和油中的这几种粮油成分，琼脂糖凝胶电泳进行了进一步确认了检测结果。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

芝麻油、菜籽油、稻米油以及调和油：市售（见表1）；乙二胺四乙酸（EDTA）：购于Sigma公司；氯仿（AR），聚乙二醇 20000（PEG20000），无水乙醇（AR）：购于国药集团公司；表面羧基修饰的磁珠（500 nm）：作者所在实验室合成；实时荧光PCR超混液：诺唯赞公司产品；检测芝麻油、菜籽油、稻米油内源基因所用引物序列：生工生物有限公司合成。

1.2 主要仪器

CFX96TM实时荧光定量 PCR检测系统：Bio-Rad公司产品；恒温烘箱：上海森信实验仪器有限公司产品；摇床：江苏金坛市盛蓝仪器制造有限公司产品；Heal Force Neofuge 18R台式高速冷冻离心机：上海力新仪器有限公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 磁性纳米材料 表面带COOH磁珠的制备是采用溶剂热法加入柠檬酸钠一步法制备[14-15]。该制备方法步骤简单，合成的粒子分散性好，较为稳定。

1.3.2 实时荧光PCR检测方法建立及优化 芝麻[16]、菜籽[17-18]、稻米[16]的内源基因对应的引物序列参考文献获得并由上海生工生物有限公司合成，并列于表2。芝麻、菜籽、稻米用液氮在陶瓷研钵中研磨，然后采用天根（北京）植物基因组DNA提取试剂盒提取种子中的基因组DNA。将提取的基因组DNA用灭菌的超纯水进行3倍梯度稀释后作为模板DNA。RT-PCR采用 20 μL体系，即 10 μL 2X 的VazymeTMSuperMix，0.4 μL 10 μmol/L的正向引物，0.4 μL 10 μmol/L的反向引物，模板DNA 2 μL，7.2 μL的灭菌超纯水。之后用移液枪混匀样品并进行RT-PCR检测，扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳进行确证。由于采用的RT-PCR超混液中已含有适宜浓度的Taq DNA酶、dNTPs、MgCl2、荧光染料、反应缓冲液等，影响实验效果的主要因素即为引物浓度和PCR扩增条件（退火温度）。因此，实验研究了引物浓度，退火温度对RT-PCR的影响。

1.3.3 磁珠法提取食用植物油中DNA 取15 mL pH 8.5的 50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA到50 mL离心管中，加入30 mL食用油样品，充分震荡后置于摇床上，室温震荡条件下乳化1 h。8 000 r/min，10 min离心，去除上层油脂并添加30 mL食用油样品。重复步骤1和2直至乳化150 mL食用油样品。如离心后出现水油乳化层，可通过65℃温浴破乳，吸去剩余乳化层并添加pH 8.5的50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA使得水相体积保持在15 mL。向乳化后的水相中添加等体积的氯仿，充分混匀后8 000 r/min离心10 min保留下层水相。该步骤可重复一次以保证充分去除水相中的食用油，避免磁珠发生聚集降低产率。1 mL水相中加入550 μL质量分数27%PEG和6 mol/L NaCl溶液，100 μL 10%的SDS，30 μL磁珠，70℃水浴15 min。磁分离去除上清，并用体积分数70%乙醇洗涤磁珠3次，37℃烘箱15 min烘干后加入50 μL pH 7.3的10 mmol/Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，65℃水浴15 min。磁分离，吸取上清即为提取的粮油样品DNA。研究所用磁珠为粒径在400~500 nm，表面修饰的Fe3O4磁性材料，与市售磁珠相比分散性，磁相应性更好，-COOH修饰的磁珠比-OH、-NH2修饰的磁珠相比提取效果更好。针对目前粮油DNA提取样品量大、提取效率低的特点，首先采用转相的方法将油中残留DNA富集到水相，再利用磁珠超顺磁性和快速、高效富集DNA的特点从较少粮油样本中成功提取了DNA，方便后续采用PCR手段检测粮油种属特性、转基因等。

1.3.4 粮油内源基因实时荧光PCR检测方法的建立 磁珠提取食用油中DNA后参考1.3.1中的方法进行检测，检测结果通过琼脂糖凝胶电泳进行确认。

2 结果与分析

2.1 芝麻、菜籽、稻米种子内源基因实时荧光PCR检测方法建立及优化

提取的种子基因组DNA经微量紫外（Thermo scientific，上海）测定提取DNA的A260nm/A280nm均在1.7~1.9之间，质量浓度在0.66~1.2 μg/L之间，满足实验需要。实验采用的靶标基因2S Albumin、SPS、PE3-PEPcase分别是芝麻、稻米、菜籽的内源基因，具有种属特异性，选用这些靶标基因和对应的引物进行PCR扩增检测可以很好的区分不同粮油作物的品种，从而提高粮油品种鉴定的特异性和准确性。引物浓度的优化说明400 nmol/L/L时容易出现引物二聚体的情况；引物浓度在200 nmol/L/L时荧光信号强度适中，并可以减少引物二聚体的影响；引物浓度在100 nmol/L/L时荧光强度显著下降至1 000左右。因此RT-PCR体系中最终使用的引物浓度为200 nmol/L/L。退火温度对于扩增效率和减少引物二聚体影响较大，实验发现对于芝麻基因组DNA扩增，60℃时RT-PCR效率较高。但对于稻米和油菜籽基因组DNA扩增，退火温度为55℃时RT-PCR扩增效率比58℃和60℃时高。优化后芝麻、菜籽、稻米种子内源基因实时荧光PCR的扩增条件见表3。

优化后芝麻、菜籽、稻米种子内源基因RT-PCR扩增曲线和溶解曲线如图1所示。芝麻内源基因2S Albumin RT-PCR扩增在33个循环以后的扩增梯度较差，产物的解链温度为81.5℃。大米内源基因SPS RT-PCR扩增在36个循环以后的扩增梯度较差，产物的解链温度为81℃。油菜种子内源基因PE3-PEPcase RT-PCR扩增在30个循环以后的扩增梯度较差，产物的解链温度为83℃。单一的溶解温度说明扩增的特异性较好，引物二聚体影响较小。

琼脂糖凝胶电泳（图2）分析实时荧光PCR扩增产物表明RT-PCR扩增产物均为单一条带，扩增产量随原始基因组浓度（自左向右）降低而降低；芝麻内源基因2S Albumin扩增产物相对分子质量在75 bp左右，与文献报道66 bp一致[16]。大米内源SPS基因扩增产物相对分子质量在75~100 bp之间，与文献报道81 bp一致[16]。油菜种子内源PE3-PEPcase基因扩增产物相对分子质量在100~150 bp之间。产物长度与文献报道121 bp一致[17-18]。因此，芝麻、稻米、菜籽种子内源基因实时荧光PCR扩增体系成功建立，可以用于芝麻油、稻米油、菜籽油中内源基因的扩增。

2.2 实时荧光PCR鉴定纯芝麻油、菜籽油、稻米油粮油品种

纯芝麻油、菜籽油、稻米油样品均先采用磁珠法进行提取并用于RT-PCR检测。扩增曲线，扩增产物的溶解温度（图3）以及琼脂糖凝胶电泳（图4）显示检测结果与对应种子基因组扩增产物的溶解温度和片段大小保持一致，进而说明测试的3种芝麻油、3种菜籽油、3种稻米油可以成功扩增出芝麻油、油菜籽、大米相应的内源基因。由于购买的食用油既有压榨工艺也有溶剂浸出，说明不同工艺下的纯芝麻油、菜籽油、稻米油中DNA均可以用已建立的磁珠法提取出来，并实现这3种食用植物油的品种的鉴定。

2.3 实时荧光PCR鉴定调和油中芝麻油、菜籽油、稻米油成分

为进一步验证该方法可以鉴定粮油品种真实性，3种调和油粮油样品均先采用磁珠法进行提取并用于RT-PCR检测。扩增曲线，扩增产物的溶解温度（图5）以及琼脂糖凝胶电泳（图6）显示3种调和油中均可以检测到芝麻内源基因，与商品标签标识一致；仅福临门五谷调和油可以检测到大米内源基因，与商品标签标识一致（金龙鱼调和油和香满园调和油成分标识中无稻米油成分）；3种调和油中均可以检测到油菜内源基因，其中金龙鱼调和油和福临门调和油与商品标签标识一致，香满园调和油中标识未含有菜籽油但检出菜籽油内源基因，具体原因需要进一步确认。所有检测结果与对应种子基因组扩增产物的溶解温度和片段大小保持一致，表明测试的3种调和油中芝麻油、菜籽油、稻米油成分的内源基因可以成功扩增出，进而实现对于调和油中粮油品种的鉴定。

3 结语

PCR方法鉴定粮油品种和掺假，具有适应性强、易于推广的优点。食用油经过压榨、高温或者化学溶剂处理，基因组DNA含量极低且多分解为小片段，普通的基因组DNA提取方法无法提取粮油样品中的DNA。针对这些特点，作者首先通过乳化将油相中DNA转移到水相中，再利用磁纳米粒子的超顺磁性以及其在高盐浓度下可以特异性吸附DNA的特点进一步富集水相中DNA。该方法具有成本低、DNA富集效率高、样本量小、简便、适合高通量的特点。研究结果表明，经实时荧光PCR检测，市场上纯芝麻油、菜籽油、稻米油以及调和油中的这些成分均可检出，该方法为粮油品种真实性表征和掺假检测提供了有效手段。

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科技信息

加拿大批准广布肉毒杆菌M35作为抑菌防腐剂

据加拿大卫生部消息，10月13日加拿大卫生部发布公告，批准广布肉毒杆菌（Carnobacterium divergens）M35作为防腐剂用于部分食品。

据了解，加拿大卫生部收到一项食品添加剂申请，请求采用广布肉毒杆菌M35抑制即食冷熏三文鱼切片与即食冷熏鳟鱼切片当中的李斯特菌。

经过相应评估，加拿大卫生部认为，广布肉毒杆菌M35作为李斯特菌抑制剂是安全的。加拿大卫生部于6月7日就此发布提案，并设定了75天的评议期。在评议期内，加拿大卫生部收到一项意见，然而并未收到与加拿大卫生部安全性评估不一致的资料。

因此，加拿大卫生部批准广布肉毒杆菌M35作为抑制李斯特菌的防腐剂，用于即食冷熏三文鱼切片与即食冷熏鳟鱼切片。

［信息来源］食品伙伴网.加拿大批准广布肉毒杆菌M35作为抑菌防腐剂[EB/OL].(2016-10-14).http://news. foodmate.net/2016/10/399565.html

Identification of Authenticity of Sesame Oil,Rapeseed Oil and Rice Oil Based on the Magnetic Beads

GE Wenliang1， WANG Wenbin2， XU Chuanlai2
（1.Wuxi No.2 People's Hospital，Wuxi 214002，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The detection of endogenous genes using PCR is one of the effective methods to detect the variety of edible vegetable oil and identify their adulteration.Due to the extremely low content of DNA in the refined oil,the effective extraction method to concentrate DNA is the crucial challenge concerning the authenticity identification based on PCR.The DNA concentrated method based on magnetic beads was established in this paper.DNA was extracted using this method from the edible oil including sesame oil,rapeseed oil and rice oil.Their endogenous genes was then characterized by real-time fluorescence PCR.The endogenous genes were successfully detected using concentrated DNA extracted after five emulsifications and further by magnetic beads.The results were further confirmed by the agarose gel electrophoresis.The qualitative identification of edible oil using magnetic beads was achieved.

Magnetic beads,PCR,edible vegetable oil,DNA extraction

TS 225.1；TS 207.3

A

1673—1689（2016）11—1224—08

2015-02-16

国家“十二五”科技支撑计划项目（2012BAC01B07）。

葛文亮（1965—），男，江苏无锡人，主任技师，主要从事临床医学检验与免疫学研究。E-mail：2324999898@qq.com