卵黄高磷蛋白调控生物矿化的研究进展

介怡琳，陈 婵，刘晴丽，马美湖，黄 茜*

（华中农业大学食品科学技术学院，蛋品加工技术国家地方联合工程研究中心，湖北 武汉 430070）

卵黄高磷蛋白调控生物矿化的研究进展

介怡琳，陈 婵，刘晴丽，马美湖，黄 茜*

（华中农业大学食品科学技术学院，蛋品加工技术国家地方联合工程研究中心，湖北 武汉 430070）

近年来研究发现磷酸化蛋白质在生物矿化过程中起着重要的作用，而卵黄高磷蛋白是目前自然界中磷酸化程度最高的蛋白质之一，已有部分研究证明了卵黄高磷蛋白具有矿化调节作用，但关于它调控矿化的活性位点及具体机制还不明确。本文概述了生物矿化发生的环境、矿化原理、矿化过程及矿化调控等内容，对卵黄高磷蛋白调控生物矿化的相关假说及研究进展进行了探讨。

卵黄高磷蛋白；生物矿化；调控机制；鸡蛋

近年来，人们已经认识到磷酸化蛋白质（phosphoprotein）在仿生矿化过程中起到很重要的作用［1］，国内外一些科学家研究了骨桥蛋白、牙本质磷蛋白等磷蛋白调节生物矿化的过程，有望为仿生材料的研究带来突破。卵黄高磷蛋白（phosvitin，PV）是鸡蛋蛋黄中的一种高度磷酸化糖蛋白［2］，其含磷量占蛋黄总磷量的80%，且具有能捕捉金属离子的特性，在鸡胚骨骼发育中起着重要作用。然而作为一种典型的磷蛋白，其发挥调节生物矿化的具体作用机制并没有得到充分的认识，相关的研究进展比较缓慢。本文综述了PV调控生物矿化的相关假说及研究进展。

1 生物矿化与磷蛋白

1.1 生物矿化概述

生物矿化是指于生物体不同部位的特定环境中，在有机基质和细胞等的共同参与下，环境中无机元素选择性地在特定有机基质上形核、生长、相变，最终转变为高度有序的生物矿物的过程［3］。

生物矿化发生的大环境是细胞外或细胞内，它提供了矿化所需的特定的温度、pH值和矿物离子等条件，同时大环境的空间结构也决定了矿物的尺寸大小及排列组装［4］。无论是细胞内还是细胞外矿化，生物矿化的精密控制过程都依赖特定的微环境：由细胞分泌的有机基质按照一定方式自组装形成的具有特定结构的矿化空间［5］。在此空间中，有机基质自组装结构通常是作为矿化体系的核心，既提供矿物形核的位点，又作为模板控制晶体的生长和组装［6］。生物矿化的基本过程包括4 个阶段：晶体生长、界面分子的识别、晶体生长的调制、晶体的外延生长与组装［7］。综合来看，这4 个阶段中同时存在着对成核位点、晶型、晶体生长方向及有序性等方面的控制。另外，有研究表明，矿化的过程往往不是直接从溶液到矿物的一步到位，而是经历无定形前驱相［8］→晶体中间相→最终矿物的连续转变［9］。生物矿化的产物即生物矿物，主要有以下特点：选择性矿化（即生物体根据其生命活动的功能需求选择性的进行矿化）、有机-无机复合结构、非热力学稳定相（即生物矿物以热力学亚稳形式存在［10］）、复杂有序的分级结构、良好的物理化学和力学性能。

1.2 生物矿化的调控

生物矿化是在基因、蛋白、基质和细胞等因素的综合作用和逐级调控下进行的［11］。纳米尺度上，基因控制着特定蛋白在特定空间时间中分泌、表达，并组装形成细胞外基质，继而启动蛋白-蛋白和蛋白-晶体等相互作用。中等尺度上，矿化组织的分级组装由多种细胞代谢活动控制。最终才形成了宏观尺度上组织结构与功能的高度配合。

在生物矿化中，胶原蛋白［12-13］、高磷蛋白［1］等蛋白质作为有机基质对矿化过程起关键调控作用。有研究发现了这种有机模板在矿化过程中的控制定向形核现象：Mann［14-15］采用Langmuir单层膜的分子有序组合体作生长基底膜，模拟碳酸钙生物矿化体系，在特定的溶液环境下探究了溶液成分、pH值、功能团、有序体结构、形态、膜表面极性头部的电荷状况以及脂双层内外凹凸曲面的化学势差异等许多因素对晶体形成与生长的影响，并由此提出了“有机-无机界面分子识别”理论。主要方式包括晶格匹配、立体化学互补、极性作用、静电作用、空间定位、表面形貌等［16］。具体来讲，有机基质的调控可以分为化学调控、空间控制、结构控制、形态控制、构象控制5 种机制［17］。这几种控制机制并不是单独作用的，而是相互配合，共同实现对晶体的全面调控。

1.3 生物矿化中磷蛋白的作用

磷蛋白是指一类含有共价结合磷酸根的结合蛋白质。众所周知，蛋白质的磷酸化作用与细胞内信号传导、基质排列、蛋白质加工密切相关。近年来研究发现，磷酸化蛋白质在生物矿化过程中起到很重要的作用［18-22］，逐渐展开了大量的研究。George等［1］在2008年对磷酸化蛋白质及其对矿化过程中晶核形成、晶体生长的促进或抑制作用进行了综述，其中骨桥蛋白的磷酸化作用使得它对矿化晶体的成核和生长有双重作用，骨涎蛋白、牙本质磷蛋白、牙本质基质蛋白都能够促进生物矿化等。磷酸化蛋白质具有参与磷酸钙晶体沉积和调控生物矿化的功能［23-24］；高度的磷酸化还使其具有参与信号调控和影响破骨细胞分化和骨重吸收的能力［25］，进而调控新骨的发育和骨创伤的愈合［26］。

Gower等［9］在研究体外胶原矿化时，使用聚天冬氨酸来代替高磷蛋白在胶原矿化中的作用，并且提出了聚合物诱导前驱体相（polymer induced liquid precursor，PILP）机制。Deshpande等［27］使用聚天冬氨酸实现了重构胶原微纤维的矿化。随后，他们分别使用釉原蛋白［28］、牙本质基质蛋白和牙本质磷蛋白［29］等研究不同高磷蛋白对磷灰石矿物形貌、取向以及胶原矿化的影响。高磷蛋白在矿化中的主要作用包括以下几点［1］：聚合物捕获离子，同时抑制晶体成核，这样导致局部的离子浓度过高，从而诱导无定形相的分离；聚合物能有效稳定无定形相，抑制其溶解，并且能使最终晶体维持无定形相的形貌；在液-液相分离过程中，聚合物能增加水化程度，这样能有效抑制其固化，从而提高其可控性。

PV是鸡蛋蛋黄中的糖磷蛋白，占蛋黄干质量的4%［30］，含有10%的磷［2］，一级氨基酸序列显示PV含有50%的丝氨酸，且近80%的丝氨酸被磷酸化［31］，是目前自然界中发现的磷酸化程度最高的蛋白质［32］。PV具有与上述磷蛋白非常相似的结构特点，都是水溶性蛋白，其一级结构中含有大量负电性氨基酸［33］，且大量氨基酸被磷酸化，相比这些磷蛋白，PV的磷酸化程度更高［34］，并且也有研究证明PV可诱导形成羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）。所以，从构效关系来说，有明确的证据证明PV对生物矿化有重要作用。

1.4 磷蛋白调控矿化研究的模型

磷蛋白调控生物矿化的实验模型主要分为体内模型和体外矿化模型两种［35］。在体外实验中，磷蛋白对矿物的沉积速率和晶体形貌具有重要影响［36-37］，而在体内实验中，磷蛋白功能的失调将导致体内受损矿化［38-39］。体内模型主要包括探究与矿化相关的磷蛋白在体内的分布状况以及基因敲除实验两种方法，但磷蛋白如骨桥蛋白在体内分布广泛，作用不止调控矿化这一种，所以只能给一些很宽泛的关于矿化的认识，并不能给出其具体的作用。另外，基因敲除实验如基质γ-羧基谷氨酸蛋白（matrix glg protein，MGP）的基因敲除实验，虽然能说明一定的问题，但基因敲除的小鼠存在除骨骼问题外的多种病患，限制了信息的获得。所以，更多的还是利用体外模型进行实验，体外模型有均相模型［40］（矿化溶液中进行矿化实验）和异相模型［41］（矿化基质上进行矿化实验）。其中异相实验体系有：利用琼脂胶体系进行矿化实验；利用合成高聚物或肽段模仿非胶原蛋白质进行矿化实验［42］；用提取的非胶原蛋白质进行矿化实验［43-44］；利用去矿化组织模型进行矿化实验［45］；利用小鼠骨骼组织进行骨吸收及骨形成模型等，目前还有部分细胞实验［46］。这些实验模型各有特点，分别从不同方面论证磷蛋白的调控矿化作用［47］。

2 卵黄高磷蛋白参与生物矿化推测

2.1 基于生物进化关系和遗传信息推测卵黄高磷蛋白参与生物矿化

早期Byrne等［48］假设认为PV只存在于脊椎动物中，故基于长期的进化关系提出了磷和Ca2+被PV运输并作为骨形成的概念。Hiramatsu等［49］将这一概念在文献中进行了很好的阐述。随后发现部分非脊椎物种也含有与脊椎动物大小相当PV区域［50-51］，从而这一概念受到了挑战。Huq等［52］表明丝氨酸密码子使用的模式揭示出基因中与矿化相关的牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）、牙本质基质蛋白（dentin matrix protein，DMP）1、骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，BSP）均有使用AGT和AGC密码子编码多磷酸化丝氨酸的偏好性，PV基因编码也有这种编码偏好性，并且这种基因编码的偏好性与生物矿化密切相关。

2.2 PV为卵生动物骨骼发育提供磷

骨组织的细胞间质由有机质和无机质构成，有机质由骨细胞分泌产生，约占骨质量的1/3，其中约95%是胶原纤维，其余是无定形基质，即中性或弱酸性的糖胺多糖组成的凝胶。无机质主要是钙盐，约占骨质量的2/3，主要成分为羟基磷灰石结晶，是一种不溶性的中性盐，呈细针状，沿胶原纤维的长轴排列［53］。由此可见，磷是骨组织的重要组成元素。对卵生动物而言，骨骼在矿化过程中所需的大量磷必然由卵中含磷物质提供。以鸡蛋为例，PV是蛋黄中的主要磷蛋白，占蛋黄干质量的2%，含磷9.7%，占蛋黄总磷量的80%。鸡胚胎发育过程中的几乎全部营养物质都由鸡蛋提供，因此不难推断，组成鸡胚骨骼的重要矿物羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）中的磷大部分由PV提供，所以有理由认为PV在生物矿化中起着重要作用。

Finn等［54］发现PV在浮游产卵硬骨鱼类中表达，随后在卵母细胞成熟过程中去磷酸化，释放磷调节卵母细胞的渗透压。Moran等［55］称PV有可能在胚胎发育过程中通过释放磷结合钙而提供连续的骨矿化。Finn［56］也提出假设认为PV可能参与骨骼的形成。李春艳［34］研究了鸡胚胎发育过程中PV的变化，证实了PV与鸡胚骨骼发育密切相关，并且是通过脱磷酸化提供鸡胚骨骼形成需要的磷。

2.3 PV替代VC促进胶原合成与骨矿化

研究表明VC在胶原合成及维持其稳定性、新陈代谢、免疫力方面有重要作用，但吃惊的是许多物种丧失了合成VC的能力，故而只能从外界摄取VC以维持自身的需要，研究显示生物体缺乏合成VC的原因是因为进化压力导致的催化VC合成所需的最后一步的古洛糖酸内酯氧化酶（L-gulono-γ-lactone oxidase，GLO）基因的丧失。在矿化诱导过程中VC作为抗氧化剂/还原剂，是合成胶原的必需物质，从而进一步形成和维持结缔组织、器官和骨骼系统［57］。科学家进一步研究发现，一些需要进行体外胚胎发育的物种可以在VC缺失的情况下很好地进行组织骨骼连接，究其原因，是由于这些物种都含有PV，并且PV像VC一样具有强烈的抗氧化性，可以促进胶原合成并维持其稳定性，于是部分科学家将目光锁定在PV上，并开展了一系列研究。他们假设PV能在VC缺失的情况下促进胶原形成，骨骼发育。Jess等［58］于2013年基于这个假设设计了一系列实验（基于小鼠颅骨去矿化组织的再矿化模型），有力地证明了PV在体外骨组织矿化过程中的生物作用。

2.4 生物信息学分析推测PV可能具有调控生物矿化的功能

张晓维［59］利用生物质谱技术结合生物信息学预测分析表明PV含有87 个磷酸化位点（83 个磷酸丝氨酸和4 个磷酸苏氨酸）。利用生物信息学分析9 个物种来源的11 种PV以及来源于人体的5 种磷酸化蛋白质，进行氨基酸组成、多序列比对和进化树分析，显示均含有高丝氨酸，且富含酸性氨基酸。氨基酸组成上的特点决定了这些蛋白质在结构和功能上的相似性，如高级结构均为高度灵活的无规卷曲结构；均具有结合多价金属离子的能力［60］；均有使用AGC和AGT密码子编码多磷酸化丝氨酸的偏好性［52］；磷酸化位点不均一性。分析发现鸡的PV与牙本质磷蛋白的结构及特性相似，进化关系较近，意味着PV可能具有与牙本质磷蛋白相似的生物功能，即在生物矿化过程中发挥重要的调控作用。

3 PV调控生物矿化研究

3.1 PV调控矿化的体外研究

大量的体外研究表明PV具有调控矿化的作用，许多体外研究是基于将PV吸附或共价结合到某种基质上的模型开展研究的。Linde等［61］将PV共价交联固定在琼脂糖珠上，置于矿化溶液中培养，表明PV可以诱导矿化物的形成，而去磷酸化后的PV诱导效果明显减弱。Saito等［62］研究发现当PV吸附到胶原蛋白上时，置于矿化液中后会从胶原蛋白上解析下来，且不能诱导矿物形成；而当PV共价交联到胶原蛋白上时，会诱导磷灰石沉积于胶原蛋白表面，且去磷酸化后诱导矿物形成所需时间大大延长，表明PV的磷酸基团在矿化中起到重要作用。Kobayashi等［63］也做了类似的实验，同样发现PV可以促进磷灰石的形成。Onuma等［64］发现当PV处于游离态时抑制无定型磷酸钙转化为羟基磷灰石，而当PV固定在胶原蛋白上时，HA不是直接由无定型磷酸钙（amorphous calcium phosphate，ACP）内部重建形成，而是在ACP上异相成核得到。Abdelkebir等［65］也有相关研究表明PV可以促进矿化。Abdelkebir等［65］采用仿生膜矿化体系，研究了羧酸盐、硫酸盐和磷酸化蛋白质对矿化的调控作用，其中，以PV为代表的磷蛋白促进矿化的效果最好。Ito等［66］将PV用二乙烯砜固定在琼脂糖珠上，发现PV可以显著促进矿化，并指出其可能有助于促进软化的牙本质再矿化。William等［67］还利用二氧化硅纳米粒子上的磷酸钙仿生矿化模型研究了PV在不同pH值条件下的表面电荷等生化特性对矿化的影响，对骨组织工程生物医学材料的应用有相应的借鉴意义。

PV强大的钙结合能力与它的矿化作用密切相关，许多体外实验研究了PV与钙离子的相互作用。PV的磷酸丝氨酸区域是负电荷的高度聚集区，提供了钙离子和铁离子等金属离子的螯合区域［68］。Osaki等［69］研究发现PV与钙在pH 6.5时，每摩尔PV可以结合160 mol钙离子。Belhomme等［70］研究发现，在气-水界面中，磷酸丝氨酸残基之间形成分子间磷酸钙桥可以形成PV-Ca聚集物，并进一步在PV分子之间构成横向交互的巨型网络。张晓维［59］利用钙离子浓度计、等温滴定量热仪、圆二色谱和荧光光谱方法，分别从化学、热力学以及结构信息方面，较为全面地研究了PV与钙离子的相互作用，表明PV与钙离子存在多位点相互作用，在不同环境下作用方式不一样。PV磷酸肽也具有很强的螯合矿物离子的能力和促进钙吸收的能力［71-73］。Choi等［71］证实了PV磷酸肽能提高钙的生物利用度及钙在骨骼中的聚集。

最新的研究表明磷酸化是生物矿化的关键［74-75］。Salih［76］和Gericke［77］等都有研究发现磷蛋白的磷酸化程度对其参与矿化调控具有极为重要的作用。磷蛋白的磷酸化程度还可以调控其与HAP的相互作用，进而对HAP的成核和生长产生不同的影响［1］。Zhang Xiaowei等［78］系统研究了仿生矿化体系中PV对磷酸钙矿物晶相转化的影响。体外均相矿化溶液矿化实验表明PV促进磷酸钙矿物形成是一个动态过程，即在起始阶段参与到矿化反应中，矿物形成后，PV又从晶体中缓慢释放出来。张晓维［59］进一步将PV酶解处理，研究了磷酸化程度、特征肽段组成及大小等结构对其诱导矿化的影响，寻找其诱导矿化的作用位点，揭示其诱导矿化的构效关系，发现磷酸化在矿化反应中起到很重要的作用，经质谱鉴定可知促进矿化的活性区域为D1165R1258，即PV核心的磷酸化丝氨酸簇区域。

3.2 PV调控矿化的细胞学研究

结合细胞学进行体外细胞实验，利用骨形成、骨吸收中的一系列生化指标（碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）、相关基因mRAN测定、相关蛋白测定、钙释放与摄取功能、骨吸收坑、矿化结节形成等）研究PV对矿化的影响也是一个重要手段［79-80］。李春艳［34］研究了PV对鸡胚胎骨骼发育的影响，结合体内外实验初探其机制。通过比较分析孵化期间PV磷酸根含量、二级结构、鸡胚腔骨ALP活力、体长增长率这些指标的变化，发现了PV通过脱磷酸化提供鸡胚骨骼形成需要的磷。随后采用细胞实验建立模型初探了PV促进MC3T3-E1细胞矿化的可能机制，推测在诱导矿化的过程中PV替代了VC的作用，作为强抗氧化剂/还原剂参与合成胶原，进而促进成骨活动，PV通过上调I型胶原蛋白Col-I mRNA和骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）mRNA的表达，促使其下游产物ALP表达水平增加，进而诱导矿化活动增强。但是PV对成骨细胞影响详细的细胞学和分子学机制仍需进一步研究确定。Jess［58］基于小鼠颅骨去矿化组织的再矿化模型设计了一系列实验，分别模拟成骨过程和破骨过程，有力地证明了PV在体外骨组织矿化过程中的生物作用，即促进成骨过程，抑制破骨过程。

3.3 PV调控矿化的其他研究

以上体系都是PV对磷酸钙矿化体系的调控，Fan Jiadong等［81］最近研究了PV对碳酸钙矿化体系的调控作用，研究PV对碳酸钙结晶纳米结构的影响，动力学实验表明PV抑制高浓度过饱和溶液纳米晶体的组装而促进低浓度过饱和溶液中定向纳米晶的组装。Khalil等［82］将PV固定在层层自组装（layer-by-layer self-assembly，LBL）涂料上，制成LBL仿生架构研究PV对碳酸钙晶体矿化的影响。结果也证实PV促进碳酸钙的结晶矿化。总之，PV对生物矿化的调控作用的研究涉及基因、分子、细胞层次，包括体内体外模型，相关研究分别从不同方面论证了PV的矿化调控作用。

4 结 语

目前虽然对PV调控矿化的能力进行了许多研究，但其活性位点及具体的矿化机制尚未明确。应进一步分离制备高纯度的PV，对其结构进行表征，鉴定其磷酸化位点。作为生物活性大分子，还需要进一步从细胞分子水平以及体内实验进行研究和验证。同时，作为潜在的仿生矿化材料，还需开展其应用研究，如生物相容性、材料硬度等。研究PV在矿化中的作用成为一个重要方向，寻找其诱导矿化的活性位点，揭示其诱导矿化的构效关系，为继续阐明PV在鸡胚骨骼发育中的生物学作用［83-84］，同时也为利用PV诱导生物矿化、合成仿生骨骼材料等应用研究提供相应的理论基础。

［1］ GEORGE A， VEIS A. Phosphorylated proteins and control over apatite nucleation， crystal growth and inhibition［J］. Chemical Reviews，2008， 108 （11）： 4670-4693. DOI：10.1021/cr0782729.

［2］ 宋儒坤， 李斌， 马美湖. 卵黄高磷蛋白的功能与应用研究［J］. 中国家禽， 2011， 33（16）： 40-42.

［3］ 程振江. 蛋白调控骨、牙矿化的研究及模拟［D］. 北京： 清华大学，2010： 1-10.

［4］ WEINER S L. Crystallization pathways in biomineralization［J］. Annual Review of Materials Research， 2011， 41（1）： 21-40. DOI：10.1146/annurev-matsci-062910-095803.

［5］ 黄兆龙， 何英， 刘卫， 等. 胶原生物矿化反应的冻结及其矿化机制研究［J］. 稀有金属材料与工程， 2009， 38（增刊2）： 842-845. DOI：10.3321/j.issn：1002-185X.2009.z2.225.

［6］ GAJJERAMAN S， KARTHIKEYAN N， HAO J J. Matrix macromolecules in hard tssues control the nucleation and hierarchical assembly of hydroxyapatite［J］. Journal of Biological Chemistry， 2007，282（2）： 1193-1204.

［7］ CENKER Ç Ç， BOMANS P H H， FRIEDRICH H， et al. Peptide nanotube formation： a crystal growth process［J］. Soft Matter， 2012，8（28）： 7463-7470. DOI：10.1039/C2SM25671A.

［8］ WILLIAM J L， FREDERICK H S. Mineral deposition in the extracellular matrices of vertebrate tissues： identification of possible apatite nucleation sites on type I collagen［J］. Cells Tissues Organs，2009， 189（1/4）： 20-24. DOI：10.1159/000151454.

［9］ LAURIE B G. Biomimetic model systems for investigating the amorphous precursor pathway and its role in biomineralization［J］. Chemical Reviews， 2008， 108（11）： 4551-4627.

［10］ BENIASH E， METZLER R A， LAM R S K， et al. Transient amorphous calcium phosphate in forming enamel［J］.Journal of Structural Biology， 2009， 166（2）：133-143. DOI：10.1016/ j.jsb.2009.02.001.

［11］ MANN S. Biomineralization and biomimetic materials chemistry［J］. Journal of Materials Chemistry， 1995， 5（7）： 935-946. DOI：10.1039/ JM9950500935.

［12］ LI Y P， SANGSOO J. Biomimetic mineralization of woven bone-like nanocomposites： role of collagen cross-links［J］. Biomacromolecules，2012， 13（1）： 49-59.

［13］ NUDELMAN F， BOMANS P H H， GEORGE A， et al. The role of the amorphous phase on the biomimetic mineralization of collagen［J］. Faraday Discuss， 2012， 159（1）： 357-370. DOI：10.1039/C2FD20062G.

［14］ MANN S. Biomineralization： the hard part of bioinorganic chemistry［J］. Journal of the Chemical Society Dalton Transactions，1993， 1（1）： 1-9. DOI：10.1039/dt9930000001.

［15］ MANN S. Molecular recognition in biominerallization［J］. Nature，1998， 332（19）： 119-124. DOI：10.1007/978-4-431-68132-8_8.

［16］ MANN S. Molecular tectonics in biomineralization and biomimetic materials chemistry［J］. Nature， 1993， 365： 499-505.

［17］ COLFEN H， MANN S. Higher-order organization by mesoscale self-assembly and transformation of hybrid nanostructures［J］. Chemistry Multidisciplinary， 2003， 42（21）： 2350-2365. DOI：10.1002/ anie.200200562.

［18］ STETLER S W， VEIS A. Bovine dentin phosphophoryn： calcium ion binding properties of a high molecular weight preparation［J］. Calcified Tissue International， 1987， 40（2）： 97-102. DOI：10.1002/ anie.200200562.

［19］ XIAO S X， YANG J， SHI Y Z， et al. Dentinogenesis imperfecta 1 with or without progressive hearing loss is associated with distinct mutations in DSPP［J］. Nature Genetics， 2001， 27（2）： 201-204. DOI：10.1038/84848.

［20］ SALIH E，WANG J， FLUCKIGER R， et al. Natural variation in the extent of phosphorylation of bone phosphoproteins as a function of in vivo new bone formation induced by demineralized bone matrix in soft tissue and bony environments［J］. Biochemical Journal， 2002， 364：465-474. DOI：10.1042/bj20011272.

［21］ KWAK S Y， BENIASH E， YAMAKOSHI Y， et al. Role of 20-kDa amelogenin phosphorylation in calcium phosphate formation in vitro［J］. Journal of Biological Chemistry， 2009， 284（28）： 18972-18979. DOI：10.1074/jbc.M109.020370.

［22］ VINCENT S T， JAMES L E， WEN J Z， et al. Secreted kinase phosphorylates extracellular proteins that regulate biomineralization［J］. Science， 2012， 336： 1150-1153. DOI：10.1126/science.1217817.

［23］ HE G， VEIS A， GEORGE A， et al. Phosphorylation of phosphophoryn is crucial for its fonction as a mediator of biomineralization［J］. Journal of Biological Chemistry， 2005， 280（39）： 33109-33114. DOI：10.1074/ jbc.M500159200.

［24］ TAY F， PASHLEY D. Biomimetic remineralization of resin-bonded acid-etched dentin［J］. Journal of Dental Research， 2009， 88（8）： 719-724. DOI：10.1177/0022034509341826.

［25］ CURTIN P， MCHUGH K P， SALIH E， et al. Modulation of bone resorption by phosphorylation state of bone sialoprotein［J］. Biochemistry， 2009， 48（29）： 6876-6886. DOI：10.1021/bi900066b.

［26］ SALIH E， ZHOU H Y， GLIMCHER M J. Phosphorylation of purified bovine bone sialoprotein and osteopontin by protein kinases［J］. Journal of Biological Chemistry， 1996， 271（28）： 16897-16905.

［27］ DESHPANDE A S， BENIASH E. Bioinspired synthesis of mineralized collagen fibrils［J］. Crystal Growth & Design， 2008， 8（8）： 3084-3090. DOI：10.1021/cg800252f.

［28］ DESHPANDE A S， FANG P A， BENIASH E， et al. Amelogenincollagen interactions regulate calcium phosphate mineralization in vitro［J］. The Journal of Biological Chemistry， 2010， 285（25）： 19277-19287. DOI：10.1074/jbc.M109.079939.

［29］ DESHPANDE A S， FANG P A， BENIASH E， et al. Primary structure and phosphorylation of dentin matrix protein 1（DMPl）and dentin phosphophoryn（DPP） uniquely determine their role in biomineralization［J］. Biomacromolecules， 2011， 12（8）： 2933-2945. DOI：10.1021/bm2005214.

［30］ KO K Y， LEE E J， AHN D U， et al. A simple and efficient method for preparing partially praified phosvitin from egg yolk using ethanol and salts［J］. Poultry Science， 2011， 90（5）： 1096-1104. DOI：10.3382/ ps.2010-01138.

［31］ LEI B， WU J P. Purification of egg yolk phosvitin by anion exchange chromatography［J］. Journal of Chromatography A， 2012， 1223： 41-46. DOI：10.1016/j.chroma.2011.12.023.

［32］ ANTON M. Composition and structure of hen egg yolk［M］// HUOPALAHTI R， LÓPEZ-FANDIÑO R， ANTON M， et al. Bioactive egg compounds. Berlin， German： Springer Berlin Heidelberg， 2007：1-6. DOI：10.1007/978-3-540-37885-3_1.

［33］ 葛丽华， 张敏， 张海燕， 等. 卵黄高磷蛋白对人牙髓细胞增殖的影响［J］. 北京口腔医学， 2013， 21（1）： 27-29. DOI：10.3969/j.issn.1006-673X.2013.01.007.

［34］ 李春艳. 卵黄高磷蛋白对鸡胚胎骨骼发育的影响［D］. 武汉： 华中农业大学， 2014： 40-50.

［35］ FABIO N， ALEXANDER J， ELI D， et al. In vitro models of collagen biomineralization［J］. Journal of Structural Biology， 2013， 183： 258-269. DOI：10.1016/j.jsb.2013.04.003.

［36］ CHEN Y， BAL B， GORSKI J. Calcium and collagen binding properties of osteopontin， bone sialoprotein， and bone acidic glycoprotein-75 from bone［J］. The Journal of Biological Chemistry，1992， 267： 24871-24878.

［37］ WALLWORK M， SMITH D， CLARKSON B， et al. Binding of dentin noncollagenous matrix proteins to biological mineral crystals：an atomic force microscopy study［J］. Calcified Tissue Iinternational，2002， 71（3）： 249-256. DOI：10.1007/s00223-001-1011-4.

［38］ WANG K F， LENG Y， LU X， et al. Calcium phosphate bioceramics induce mineralization modulated by proteins［J］. Materials Science and Engineering C， 2013， 33（6）： 3245-3255. DOI：10.1016/j.msec.2013.04.004.

［39］ SREENATH T， THYAGARAJAN T， KULKAMI A B， et al. Dentin sialophosphoprotein knockout mouse teeth display widened predentin zone and develop defective dentin mineralization similar to human dentinogenesis imperfecta type III［J］. The Journal of Biological Chemistry， 2003， 278（27）： 24874-24880. DOI：10.1074/jbc. M303908200.

［40］ BLEEK K， ANDREAS T. New developments in polymer-controlled，bioinspired calcium phosphate mineralization from aqueous solution［J］. Acta Biomaterialia， 2013， 9（5）： 6283-6321. DOI：10.1016/ j.actbio.2012.12.027.

［41］ DAI L， QI Y P， NIU L N. Inorganic organic nanocomposite assembly using collagen as a template and sodium tripolyphosphate as a biomimetic analog of matrix phosphoprotein［J］. Crystal Growth & Design， 2011， 11（8）： 3504-3511. DOI：10.1021/cg200663v.

［42］ 王磊， 白薇， 冯海兰. 自组装寡肽分子T2的体外矿化研究［J］.生物医学工程学杂志， 2007， 24（4）： 798-801. DOI：10.3321/ j.issn：1001-5515.2007.04.019.

［43］ ATUL S D， FANG P， JAMES P S. Amelogenin-collagen interactions regulate calcium phosphate mineralization in vitro［J］. The Journal of Biological Chemistry， 2010， 285（25）： 19277-19287.

［44］ HE G， DAHL T， VEIS A， et al. Nucleation of apatite crystals in vitro by self-assembled dentin matrix protein 1［J］. Nature Materials， 2003，2（8）： 552-558. DOI：10.1038/nmat945.

［45］ JEE S S， RAJENDRA K K， LAURIE G. Oriented hydroxyapatite in turkey tendon mineralized via the polymer-induced liquidprecursor （PILP） process［J］. Crystengcomm， 2011， 13（6）： 2077-2083. DOI：10.1039/C0CE00605J.

［46］ SUWIMON B， EILEEN G， RAFFAELLA C. The role of intracellular calcium phosphate in osteoblast-mediated bone apatite formation［J］. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2012， 109（35）： 14170-14175. DOI：10.1073/ pnas.1208916109.

［47］ 颜杨， 徐旭荣， 唐睿康， 等. 生物矿化研究中的化学模型［J］. 无机化学学报， 2011， 27（11）： 2105-2115.

［48］ BYRNE B M， GRUBER M， AB G. The evolution of egg yolk proteins［J］. Progress in Biophysics and Molecular Biology， 1989，53（1）： 33-69. DOI：10.1016/0079-6107（89）90005-9.

［49］ HIRAMATSU N， CHEEK A O， HARA A， et al. Vitellogenesis and endocrine disruption［J］. Biochemistry and Molecular Biology of Fishes， 2005， 6： 431-471. DOI：10.1016/S1873-0140（05）80019-0.

［50］ LIM E H， TEO B Y， DING J L. Sequence analysis of a fish vitellogenin cDNA with a large phosvitin domain［J］. Gene， 2001，277（1）： 175-186. DOI：10.1016/S0378-1119（01）00688-6.

［51］ SHARROCK W J， GORDON J I， BANASZAK L， et al. Sequence of lamprey vitellogenin implications for the lipovitellin crystal structure［J］. Journal of Molecular Biology， 1992， 226（3）： 903-907. DOI：10.1016/0022-2836（92）90642-W.

［52］ HUQ N L， CROSS K J， REYNOLDS E C. A review of protein structure and gene organisation for proteins associated with mineralised tissue and calcium phosphate stabilisation encoded on human chromosome 4［J］. Archives of Oral Biology， 2005， 50（7）： 599-609. DOI：10.1016/j.archoralbio.2004.12.009.

［53］ 葛俊. 牙釉质和骨的分级结构和纳米力学性能研究［D］. 北京： 清华大学， 2005： 25-45.

［54］ FINN R N， NORBERG B， FYHN H J. In vivo oocyte hydration in Atlantic halibut （Hippoglossus hippoglossus）； proteolytic liberation of free amino acids， and ion transport， are driving forces for osmotic water influx［J］. Journal of Experimental Biology， 2002， 205（2）： 211-224.

［55］ MORAN E. Nutrition of the developing embryo and hatchling［J］. Poultry Science， 2007， 86（5）： 1043-1049. DOI：10.1093/ps/86.5.1043.

［56］ FINN R N. Vertebrate yolk complexes and the functional implications of phosvitins and other subdomains in vitellogenins［J］. Biology of Reproduction， 2007， 76（6）： 926-935. DOI：10.1095/ biolreprod.106.059766.

［57］ MANIATOPOULOS C， SODEK J， MELCHER A H. Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of yong adult rats［J］. Cell and Tissue Research， 1988， 254（2）： 317-330. DOI：10.1007/BF00225804.

［58］ JESS L， DREW C， SHIH C L， et al. Novel bioactivity of phosvitin in connective tissue and bone organogenes is revealed by live calvarial bone organ culture models［J］. Developmental Biology， 2013， 381（1）：256-275. DOI：10.1016/j.ydbio.2013.06.005.

［59］ 张晓维. 卵黄高磷蛋白的分离纯化、结构表征及功能特性研究［D］.武汉： 华中农业大学， 2014： 90-105.

［60］ CASTELLANI O， BELHOMME G， ANTON M， et al. The role of metal ions in emulsion characteristics and flocculation behaviour of phosvitin-stabilised emulsions［J］. Food Hydrocolloids， 2008， 22（7）：1243-1253. DOI：10.1016/j.foodhyd.2007.08.005.

［61］ LINDE A， LUSSI A， CRENSHAW M. Mineral induction by immobilized polyanionic proteins［J］. Calcified Tissue International，1989， 44（4）： 286-295. DOI：10.1007/BF02553763.

［62］ SAITO T， ARSENAULT A L， CRENSHAW M A. Mineral induction by immobilized phosphoproteins［J］. Bone， 1997， 21（4）： 305-311. DOI：10.1016/S8756-3282（97）00149-X.

［63］ KOBAYASHI N， ONUMA K， YAMAZAKI A. The role of phosvitin for nucleation of calcium phosphates on collagen［J］. Key Engineering Materials， 2004， 254： 537-540.

［64］ ONUMA K. Effect of phosvitin on the nucleation and growth of calcium phosphates in physiological solutions［J］. The Journal of Physical Chemistry B， 2005， 109（16）： 8257-8262. DOI：10.1021/jp044550l.

［65］ ABDELKEBIR K， MORIN G S， LADAM G. Biomimetic layer-bylayer templates for calcium phosphate biomineralization［J］. Acta Biomater， 2012， 8（9）： 3419-3428. DOI：10.1016/j.actbio.2012.05.035.

［66］ ITO S， LIJIMA M， MOTAI F. Effects of calcium salts of acidic monomers on mineral induction of phosphoprotein immobilized to agarose beads［J］. Journal of Biomedical Materials， 2012， 100（10）：2760-2765. DOI：10.1002/jbm.a.34212.

［67］ WILLIAM J Z， CHEN W J， SHASTRI V P. Influence of surface charge and protein intermediary layer on the formation of biomimetic calcium phosphate on silica nanoparticles［J］. Journal of Materials Chemistry， 2012， 22（37）： 19562-19569. DOI：10.1039/C2JM31733H.

［68］ GOULAS A， TRIPLETT E L， TABORSKY G. Oligophosphopeptides of varied structural complexity derived from the egg phosphoprotein，phosvitin［J］. Journal of Protein Chemistry， 1996， 15： 1-9. DOI：10.1007/BF01886805.

［69］ OSAKI S， PASCUAL E， FRIEDEN E. Iron oxidation and transferrin formation by phosvitin［J］. Biochemical Journal， 1975， 15（1）： 519-525. DOI：10.1042/bj1510519.

［70］ BELHOMME C， DAVID B E， ANTON M， et al. Phosvitin-calcium aggregation and organization at the air-water interface［J］. Colloids Surfaces B， 2008， 63（1）： 12-20. DOI：10.1016/j.colsurfb.2007.10.012.

［71］ CHOI I， JUNG C， HA H， et al. Effectiveness of phosvitin peptides on enhancing bioavailability of calcium and its accumulation in bones［J］. Food Chemistry， 2005， 93（4）： 577-583. DOI：10.1016/ j.foodchem.2004.10.028.

［72］ FENG F， YOSHINORI M. Phosvitin phosphopeptides increase iron uptake in a Caco-2 cell monolayer model［J］. International Journal of Food Science & Technology， 2006， 41（4）： 455-458. DOI：10.1111/ j.1365-2621.2005.01073.x.

［73］ JIANG B， MINE Y. Phosphopeptides derived from hen egg yolk phosvitin： effect of molecular size on the calcium-binding properties［J］. Bioscience， Biotechnology， and Biochemistry， 2001，65（5）： 1187-1190. DOI：10.1271/bbb.65.1187.

［74］ BAHT G， TOUNG J， GOLDBERG H， et al. Phosphorylation of Serl36 is critical for potent bone sialoprotein-mediated nucleation of hydroxyapatite crystals［J］. Biochemistry， 2010， 428（3）： 385-395. DOI：10.1042/BJ20091864.

［75］ WIEDEMANN-BIDLACK F B， SIMMER J P， MARGOLIS H C， et al. Effects of phosphorylation on the self-assembly of native full-length porcine amelogenin and its regulation of calcium phosphate formation in vitro［J］. Journal of Structural Biology， 2011， 173（2）： 250-260. DOI：10.1016/j.jsb.2010.11.006.

［76］ SALIH E， WANG Jinxi， MAH J. Natural variation in the extent of phosphorylation of bone phosphoproteins as a function of in vivo new bone formation induced by demineralized bone matrix in soft tissue and bony environments［J］. Biochemistry， 2002， 364（2）： 465-474. DOI：10.1042/bj20011272.

［77］ GERICKE A， QIN C， SPEVAK L， et al. Importance of phosphorylation for osteopontin regulation of biomineralization［J］. Calcified Tissue International， 2005， 77（1）： 45-54. DOI：10.1007/ s00223-004-1288-1.

［78］ ZHANG X W， HUANG X， MA M H， et al. Acceleration of the initial phase transformation of mineralization by phosvitin［J］. Journal of Crystal Growth， 2015， 409（1）： 44-50. DOI：10.1016/ j.jcrysgro.2014.10.001.

［79］ MÜLLER E G， WANG X H， BRBEL D S， et al. Inorganic polymeric phosphate/polyphosphate as an inducer of alkaline phosphatase and a modulator of intracellular Ca2+level in osteoblasts （SaOS-2 cells）in vitro［J］. Acta Biomaterialia， 2011， 7（6）： 2661-2671. DOI：10.1016/ j.actbio.2011.03.007.

［80］ RODRIGUEZ D E， TAILI T M， EDGARDO J T， et al. Multifunctional role of osteopontin in directing intrafibrillar mineralization of collagen and activation of osteoclasts［J］. Acta Biomaterialia， 2014， 10（1）： 494-507. DOI：10.1016/j.actbio.2013.10.010.

［81］ FAN J D， ZHANG Y， JIANG H D， et al. Hierarchical structures of self-assembled hybrid calcium carbonate： nucleation kinetic studies on biomineralization［J］. Crystengcomm， 2015， 17（29）： 5372-5376. DOI：10.1039/C5CE00621J.

［82］ KHALIL A， FABIEN G， SANDRINE M G， et al. Protein-triggered instant disassembly of biomimetic layer-by-layer films［J］. Langmuir，2011， 27（23）： 14370-14379. DOI：10.1021/la2033109.

［83］ SUN C， HU L L， LIU S S， et al. Antiviral activity of phosvitin from zebrafish danio rerio［J］. Developmental and Comparative Immunology， 2013， 40（1）： 28-34. DOI：10.1016/j.dci.2012.12.009.

［84］ 杜昶， 王迎军. 骨与牙釉质组织的生物矿化及磷酸钙材料仿生合成研究进展［J］. 无机材料学报， 2009， 24（5）： 882-888. DOI：10.3724/ SP.J.1077.2009.00882.

Research Progress on Phosvitin in the Regulation of Biomineralization

JIE Yilin， CHEN Chan， LIU Qingli， MA Meihu， HUANG Xi*
（National & Local Joint Engineering Research Center for Egg Processing Technology， College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Recent studies have found that phosphoprotein plays a very important role in biomineralization， and phosvitins possess the highest phosphorylation level among all known proteins in eggs. Phosvitin was speculated to possess regulatory effects on biological mineralization according to some previous studies， but the mechanism and active sites for regulation of mineralization are still unclear. This paper gives a brief overview of where， how and why biomineralization occurs and the way biomineralization is regulated. Recent hypotheses regarding the regulation of biomineralization by phosvitin are also discussed.

phosvitin； biomineralization； regulation mechanism； egg

10.7506/spkx1002-6630-201609041

Q512

A

1002-6630（2016）09-0220-07

介怡琳， 陈婵， 刘晴丽， 等. 卵黄高磷蛋白调控生物矿化的研究进展［J］. 食品科学， 2016， 37（9）： 220-226. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201609041. http：//www.spkx.net.cn

JIE Yilin， CHEN Chan， LIU Qingli， et al. Research progress on phosvitin in the regulation of biomineralization［J］. Food Science，2016， 37（9）： 220-226. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609041. http：//www.spkx.net.cn

2015-09-07

国家自然科学基金面上项目（31471602）；公益性行业（农业）科研专项（201303084）

介怡琳（1990—），女，硕士研究生，研究方向为蛋品科学与技术。E-mail：1562167354@qq.com

*通信作者：黄茜（1984—），女，副教授，博士，研究方向为畜产食品科学与技术。E-mail：huangxi@mail.hzau.edu.cn