六味地黄汤及其水提醇溶部位对2型糖尿病模型大鼠脂肪组织中PI3K/Akt信号通路的影响

戴 冰， 吴沁璇， 肖子曾*， 曾呈茜，曹璐婷， 欧阳林旗， 杨梦琳

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙410208）



六味地黄汤及其水提醇溶部位对2型糖尿病模型大鼠脂肪组织中PI3K/Akt信号通路的影响

戴 冰1， 吴沁璇2， 肖子曾2*， 曾呈茜2，曹璐婷2， 欧阳林旗1， 杨梦琳2

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙410208）

摘要:目的 观察六味地黄汤及其水提醇溶部位对2型糖尿病（T2DM）模型大鼠脂肪组织中PI3K/Akt信号通路的影响。方法 采用高糖、高脂饲料喂养4周后，再行腹腔注射小剂量链脲佐菌素（STZ）且空腹血糖（FBG）≥16.7 mmo1/L的大鼠建立2型糖尿病动物模型，将其随机分为空白组、模型组、罗格列酮组、六味地黄汤组和六味地黄汤水提醇溶部位组，模型组和空白组给予等量蒸馏水，给药30 d后，测各组大鼠空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS），采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）法测定各组大鼠脂肪组织胰岛素受体底物（Irs2）、磷脂酰肌醇3磷酸激酶（Pi3k）、蛋白激酶B（Akt）mRNA的表达情况。结果 六味地黄汤及其水提醇溶部位均能降低2型糖尿病大鼠FBG值及FINS水平，增强了T2DM大鼠脂肪组织Irs2、Pi3k、Akt mRNA的表达（P＜0.05）。结论六味地黄汤可能通过调节T2DM大鼠脂肪组织PI3K/Akt信号通路来干预2型糖尿病胰岛素抵抗，其水提醇溶部位为该方调节PI3K/Akt信号通路的药效物质之一。

关键词:六味地黄汤；水提醇溶部位；2型糖尿病；PI3K/Akt信号通路

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.043

网络出版日期: 2015-02-06

网络出版地址: httP://www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20150206.1144.001.htm1

2型糖尿病（T2DM）是一种多基因遗传因素、环境因素综合作用引起的内分泌代谢性疾病。其病理生理的两个中心环节是胰岛β细胞功能紊乱和胰岛素抵抗（insu1in resistance，IR）［1］，而胰岛素信号通路:磷脂酰肌醇3磷酸激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路在T2DM的发病过程中发挥着重要作用，与IR及β细胞功能障碍密切相关［2］。前段研究表明六味地黄汤及其水提醇溶部位均可降低T2DM大鼠血糖、胰岛素含有量，改善其IR［3］，其水提醇溶部位是该方水煎液经70％乙醇醇沉处理得到，主要含有苷类成分［4］:芍药苷［5］、马钱苷［6］、莫诺苷［7］等，是其干预2型糖尿病IR的药效物质之一。但该方是否通过PI3K/Akt信号通路来改善IR，从而干预了T2DM尚不知，且其药效物质是否与水提醇溶部位有关也尚未知。因此研究六味地黄汤及其水提醇溶部位对PI3K/Akt信号通路的影响对于预防T2DM的发生、发展至关重要。

1材料与方法

1.1 实验药物 六味地黄汤（熟地黄24 g，山茱萸12 g，山药12 g，牡丹皮9 g，泽泻9，茯苓9 g），湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供；罗格列酮钠片（太极集团重庆涪陵制药有限公司，批号10090198）。

1.2 动物 80只SD雄性大鼠，清洁级，体质量180～200 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号: SCXK（湘）2011-0003。

1.3 试剂 枸橼酸（批号100823），磷酸氢二钠（批号101125，购自台山市化工厂有限公司），链脲佐菌素（STZ，批号329A021，购自Sigma公司），水合氯醛（批号20100430，购自天津市科密欧化学试剂有限公司），酶联免疫（ELISA）检测试剂盒（Rat INS ELISA Kit，Cat.#: CK-E 30620R，美国R&D公司），荧光定量PCR试剂盒、组织蛋白裂解液、引物和内参GAPDH均购自长沙赛晶生物技术有限公司。

1.4 仪器 稳豪倍易型（ONETOUCH©U1traEasyTM）血糖仪及配套血糖试纸（批号3288439，强生［中国］医疗器材有限公司）；TD4-Ⅱ型台式自动平衡离心机（长沙平凡仪表有限公司）；MK3型酶标分析仪（美国Thermo公司）；7900HT型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

1.5 方法

1.5.1 药物及制备［8］称取六味地黄方10付，浸泡30 min，煎煮2次，30 min/次，合并2次滤液并水浴浓缩，得最终质量浓度为1.915 g（生药）/mL的浓缩液。取适量浓缩后的六味地黄汤，70％乙醇醇沉处理，静置24 h后真空抽滤，醇溶上清液水浴浓缩，水提醇溶部位最终质量浓度为11.326 g（生药）/mL。

1.5.2 高糖高脂饲料配方［9］普通饲料70％、猪油10％、蔗糖15％、牛胆酸钠0.5％、胆固醇2.5％、食盐2％交由湖南中医药大学动物部加工。

1.5.3 2型糖尿病IR大鼠模型的建立 大鼠适应性喂养1周，随机分为空白组和造模组，分别给予普通饲料和高糖高脂饲料喂养4周后，所有动物禁食不禁水12 h，造模组大鼠腹腔注射STZ 45 mg/（kg·d），空白对照组腹腔注射等体积枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液，STZ注射72 h（提前10 h禁食不禁水）后断尾取血检测大鼠空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS），视FBG≥16.7 mmo1/L［10］为造模成功。

1.5.4 分组给药 2型糖尿病IR大鼠模型随机分为模型组、罗格列酮组0.81 mg/（kg·d）、六味地黄汤组6.75 g生药/（kg·d）、六味地黄汤水提醇溶部位组6.75 g生药/ （kg·d）），每组14只，连续灌胃给药30 d，空白对照组和模型对照组灌服等体积蒸馏水，给药剂量按照60 kg成人与200 g大鼠体表面积折算。

1.5.5 标本采集及检测 大鼠禁食10 h，检测FBG，按0.35 g/kg计算腹腔注射10％水合氯醛麻醉，解剖，腹主动脉取血，静置1 h后分离血清-20℃冻存待检，取腹部脂肪组织，冻存于液氮中，随即置于-80℃冰箱中待检Irs2、Pi3k、Akt mRNA。采用酶联免疫ELLSA法检测大鼠血清胰岛素（FINS）水平。

1.5.6 荧光定量PCR方法检测T2DM模型大鼠脂肪组织Irs2、Pi3k、Akt mRNA的表达 每组取6只大鼠的脂肪组织标本进行mRNA的检测，采用Trizo1法抽提大鼠脂肪组织总RNA，RT-PCR反应依据Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明进行。PCR反应扩增Irs2、Pi3k、Akt所用引物如表1所示。20 μL逆转录体系中加入RNA 1 μg。核酸蛋白分析仪测定RNA量和纯度。其中磷酸甘油醛脱氢酶（GaPdh）为内参照。PCR反应采用SYBR©Premix Ex Taq（Takara）试剂，在ABI7900HT荧光定量PCR仪上进行PCR反应。使用Sequence Detection software version 1.2.3软件（APP1ied Biosystems公司）分析PCR过程各检测样本的Ct（thresho1d cyc1e）值，相对表达量用2△△Ct进行计算。

1.6 统计学分析 采用SPSS 16.0统计软件，实验数据以均数±标准差（±s）表示，统计学处理方法采用单因素方差分析。

表1　胰岛素信号引物序列

2 结果

2.1 六味地黄汤及其水提醇溶部位对T2DM模型大鼠FBG、FINS的影响 给药1个月后，模型组大鼠与空白组比较，FBG≥16.7 mmo1/L，且FBG、FINS值有显著性差异（P＜0.01），提示T2DM大鼠模型稳定胰岛素敏感性降低，发生了IR；六味地黄汤组及其水提醇溶部位组与模型组比较，大鼠FBG、FINS值有显著性差异（P＜0.05），提示六味地黄汤及其水提醇溶部位可以降低2型糖尿病IR大鼠的空腹血糖，改善IR，提高胰岛素敏感性，但均不能恢复到正常水平，与空白组比有显著性差异（P＜0.01）；罗格列酮组与模型组比较，大鼠FBG、FINS值有显著性差异（P＜0.05），提示阳性药物能够改善T2DM大鼠血糖及IR；六味地黄汤组及其水提醇溶部位组与罗格列酮组无显著性差异，提示六味地黄汤及其水提醇溶部位与阳性药物作用相似；六味地黄汤水提醇溶部位组与六味地黄汤组比较，FBG值有显著性差异（P＜0.05），提示六味地黄汤水提醇溶部位降低T2DM大鼠空腹血糖效果优于六味地黄汤。结果见表2。

表2　给药后各组大鼠FBG、F I NS值比较（±s）

表2　给药后各组大鼠FBG、F I NS值比较（±s）

注:与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，●P＜0.05，●●P＜0.01；与六味地黄汤组比较，◆P＜0.05

组别　　动物数/只FBG/（mmo1·L-1）FINS/（μIU·mL-1）空白组　6　 5.77±0.15　17.63±1.50模型组　8　 22.00±0.98**　29.80±4.11**罗格列酮组　8　 11.98±0.79**●●　20.57±0.85*●●六味地黄汤组　8　 12.51±1.32**●●　22.37±1.95**●六味地黄汤水提醇溶部位组　6　 10.33±1.25**●●◆18.82±1.66*●●

2.2 RT-PCR法测定各组大鼠脂肪组织Irs2、Pi3k、Akt mRNA的相对表达量 给药1个月后，模型组大鼠脂肪组织Irs2、Pi3k、Akt mRNA表达较空白组明显降低（P＜0.01），表明以高脂高糖喂养法复制T2DM大鼠模型在Irs2、Pi3k、Akt mRNA相对定量表达方面造模成功。给药各组与模型组比较，脂肪组织Irs2、Akt基因相对表达量极显著上升（P＜0.01），Pi3k基因表达显著上升（P＜0.05），表明罗格列酮、六味地黄汤及其水提醇溶部位可以缓解脂肪组织PI3K/Akt信号通路Irs2、Pi3k、Akt mRNA表达下降的趋势。各给药组之间相比，各指标的差异均无显著性（P＞0.05），表明罗格列酮、六味地黄汤及其水提醇溶部位对恢复T2DM大鼠脂肪组织PI3K/Akt信号通路相关基因的表达作用相似。结果见表3。

3 讨论

目前胰岛素信号转导研究较深入的PI3K/Akt信号通路与胰岛素的组织代谢效应高度相关［11-12］。胰岛素与细胞表面胰岛素受体结合，激活酪氨酸蛋白激酶（Protein tyrosine kinase，PTK），导致胰岛素受体底物1，2（insu1in recePtor substrate-1，-2，IRS-1，2）酪氨酸残基磷酸化，被磷酸化的IRS结合磷脂酰肌醇3-激酶（PhosPhatidy1inosito1 3-kinase，PI3K）P85调节亚单位，催化P110而激活PI3K，增强PI3K活性，进一步使蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB，Akt）丝氨酸残基磷酸化［13］。被激活的Akt从质膜上释放出来，转移到细胞质、线粒体和细胞核内，磷酸化各种底物，从而调节糖原合成、糖异生和葡萄糖吸收［14］。上述途径的任何一个环节受损均可导致IR。

表3　各组大鼠脂肪组织I r s 2、Pi 3 k、Ak t mRNA的相对表达量（±s）

表3　各组大鼠脂肪组织I r s 2、Pi 3 k、Ak t mRNA的相对表达量（±s）

注:与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，●P＜0.05，●●P＜0.01

组别　　动物数/只　Irs2　Pi3k　Akt空白组　6　0.34±0.13　1.16±0.14　1.26±0.23模型组　6　0.1±0.03**　0.35±0.13**　0.68±0.15**罗格列酮组　6　0.27±0.04●●　0.92±0.16●●　1.13±0.29●●六味地黄汤组　6　0.25±0.09●●　0.84±0.35●　1.07±0.10●●六味地黄汤水提醇溶部位组　6　0.25±0.07●●　1.03±0.59●●　1.10±0.24●●

由于脂肪组织是胰岛素作用的重要靶组织［15］，PI3K/ Akt信号通路也存在于脂肪组织中［16］。故本研究采用荧光实时定量PCR技术，从基因水平检测六味地黄汤及其水提醇溶部位对T2DM大鼠脂肪组织PI3K/Akt信号通路的影响。研究发现六味地黄汤及其水提醇溶部位均可降低T2DM大鼠血糖、胰岛素含有量，改善其IR，增加T2DM模型大鼠脂肪组织PI3K/Akt信号通路中Irs2、Pi3k、Akt mRNA的表达；表明六味地黄汤及其水提醇溶部位能够通过上调T2DM大鼠脂肪组织PI3K/Akt信号通路中关键基因Irs2、Pi3k、Akt的表达，促进脂肪组织胰岛素信号传递的恢复，干预IR，从而改善T2DM。这可能是其改善2型糖尿病IR的重要分子机制，该方水提醇溶部位可能为该方调节PI3K/Akt信号通路的药效物质之一。然其确切的药效物质成分是否与其含有的苷类成分有关，以及该方水提非醇溶部位对T2DM大鼠IR是否同样具有类似的干预作用，今后尚需进一步研究。

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*通信作者:肖子曾（1959—），男，教授，主要从事方剂的配伍理论及药理作用研究。Te1: 13574801749，E-mai1: 1092341361@ qq.com

作者简介:戴 冰（1964—），女，主任药师，教授，博士生导师，主要从事中药药理学及药效物质基础研究。Te1: 15973157636，E-mai1: db0223@163.com

基金项目:湖南省自然科学基金项目（13JJ3096）；湖南省科学技术厅科技计划一般项目（2010FJ4091）；湖南省教育厅重点项目（15A140）；康尔佳药业集团糖尿病研究所支持项目（2014）；长沙市科技局项目（K1106040-31）

收稿日期:2014-10-27

中图分类号:R285.5

文献标志码:B

文章编号:1001-1528（2016）02-0428-03