猪流行性腹泻病毒检测与S蛋白中和抗原表位基因分析

丁卫星，王荣谈，郭佳宏，廖学文，缪德年*

（1上海瑞丰农业科技有限公司，上海201106；2上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海201106）



猪流行性腹泻病毒检测与S蛋白中和抗原表位基因分析

丁卫星1，王荣谈1，郭佳宏2，廖学文2，缪德年2*

（1上海瑞丰农业科技有限公司，上海201106；2上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海201106）

摘 要：应用RT-PCR对2015年江苏、安徽、山东9个猪场的腹泻样品（新鲜粪便、肠道组织等）进行PEDV 和TGV检测，并对检测到的一株PEDV（CHNJPK2015）的纤突蛋白中和抗原表位基因进行克隆测序和遗传进化分析。结果表明：9个猪场PEDV检测阳性率为100％，PEDV个体阳性率为63" 89％，TGEV均未检出，说明本次流行的仔猪腹泻病主要是由PEDV感染引起的。所测毒株与参考毒株可分为3个群，CHNJPK2015株与AVCT12、Br1/87、CHM2013、LZC、SM98等毒株的S蛋白中和抗原表位基因的遗传距离较近，核苷酸序列同源性达99" 5％—99" 8％，处于同一群；而与2014年中国各地分离的CH/GDZQ/2014、FJ-FQ 2014、FJ-ZP 2014、PEDV-LY、PEDV-WS、PZ1406、SC1402、SH1404和疫苗株CV777序列的遗传距离较远，核苷酸序列同源性为92" 9％—96" 2％，处于不同的群。

关键词：猪流行性腹泻病毒；S蛋白；进化树

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是一种由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的，以严重的肠炎、腹泻、呕吐、脱水和仔猪高死亡率为显著特征的猪急性高度接触性肠道传染病。自2010年底我国猪流行性腹泻疫情暴发以来，该病持续在我国流行蔓延，给养猪生产带来了巨大的经济损失。2013年，PED首次传入美国和墨西哥，2014年扩散到加拿大、多米尼加，引起了全球的广泛关注和重视［1］。PEDV为单股正链RNA病毒，基因组全长为30 000 bp左右，编码纤突蛋白（spike protein，S）、小包膜蛋白（envelope，E）、膜糖蛋白（membrane，M）和核衣壳蛋白（nucleocapsid，N）等4种主要结构蛋白，其中S蛋白位于病毒粒子的外表面，在病毒侵入宿主细胞和诱导中和抗体产生的过程中发挥重要作用［2］。PEDV的主要中和抗原位于S基因的1 495—1 914 bp［3］。PEDV常与猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）混合感染，且这两种病毒引起的临床症状和病理变化非常相似，给临床诊断和防治增加了难度。本研究对2015年江苏、安徽、山东9个临床症状表现腹泻的猪场进行了PEDV 和TGEV的检测，并对一个分离毒株的遗传变异进行分析，以期为该病的防控提供依据。

1 材料与方法

1．1 材料

小肠及粪便样品于2015年1—4月采自江苏、安徽、山东9个发病猪场具有腹泻临床症状的仔猪。

大肠杆菌（Escherichia coli）JM109感受态细胞、pMD18-T载体、RNA提取试剂盒、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒、DL2000 DNA Marker、质粒小量提取试剂盒均为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1．2 引物

参考文献［4］设计相关引物（表1），T1和T2用于扩增TGEV的S基因，PS1和PS2用于扩增PEDV 的S基因中和抗原表位序列（1 495—1 914 bp）。引物由上海捷瑞生物科技有限公司合成。

表1　TGEV和PEDV扩增引物Table 1 Primers for TGEV and PEDV

1．3 样品处理

将采回的样品用PBS（pH＝7" 2）稀释后冻融3次，4℃12 000 r/min离心15 min，取上清200 μL按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板分别进行TGEV和PEDV的PCR扩增（98℃2 min，98℃10 s，55℃10 s，72℃1 min，30个循环，72℃延伸10 min）。扩增产物经1" 5％的琼脂糖凝胶电泳检测。

1．4 PEDV S基因的克隆与序列测定

选择条带最亮的1株PEDV（CHNJPK2015株）的PCR产物进行纯化回收，克隆于pMD18-T载体中，转化E．coli JM109感受态细胞，在LB培养基中过夜培养，用质粒小量提取试剂盒提取质粒，以PCR法鉴定重组质粒，阳性质粒交宝生物工程（大连）有限公司测序。

1．5 PEDV S蛋白中和表位基因遗传进化分析

采用DNAStar软件对测得的CHNJPK2015株PEDV S蛋白中和表位基因序列与我国其他地区的分离株、国外分离株（表2）的PEDV S蛋白中和表位基因进行同源性分析，采用MegAlign软件构建系统进化树。

表2　用于进行S蛋白中和抗原表位基因序列比较的PEDV毒株Table 2 PEDV strains for sequence comparison of neutralizing antigen epitope gene of S protein

2 结果与分析

2．1 临床样品检测

利用RT-PCR的方法对9个发生典型腹泻的猪场进行病原检测，结果表明：9个猪场PEDV检测阳性率为100％，36份病料中的23份样品检出PEDV，个体阳性率为63" 89％，而TGEV均未检出（表3），说明本次流行的仔猪腹泻病主要是由PEDV感染引起的。

表3　9个猪场的腹泻病原检测Table 3 Detection of TGEV and PEDV in 9 pig farms

2．2 PEDV S蛋白中和表位基因的扩增

以病料提取的总RNA反转录合成cDNA，并以此为模板进行PEDV S基因的扩增，扩增产物用1" 5％的琼脂糖电泳凝胶检测，目的片段约为651 bp（图1），与预期结果相符。

M：DNA Marker 2000；1：PEDV S gene图1　猪流行性腹泻病毒CHNJPK2015株S基因的RT-PCR扩增Fig．1 RT-PCRamplification of S gene of PEDV strain CHNJPK2015

2．3 PEDV S蛋白中和抗原表位基因序列分析

利用GeneBank上登录的CV777（AF353511" 1）作为参考，分析S蛋白抗原位点碱基的变化，发现了4个碱基的变化（T1501C，C1508T），导致1个位点的氨基酸发生改变（S503L）。

2．4 CHNJPK2015株S蛋白中和抗原表位基因序列同源性及进化树分析

测序后用DNAStar软件对CHNJPK2015株S蛋白抗原表位基因进行序列分析，结果表明：所测毒株与参考毒株可分为3个群，CHNJPK2015株与AVCT12、Br1/87、CHM2013、LZC、SM98等毒株的遗传距离较近，核苷酸序列同源性达99" 5％—99" 8％，处于同一群；而与2014年中国各地分离的CH/GDZQ/2014、FJ-FQ 2014、FJ-ZP 2014、PEDV-LY、PEDV-WS、PZ1406、SC1402、SH1404和疫苗株CV777序列的遗传距离较远，核苷酸序列同源性为92" 9％—96" 2％，处于不同的群；1999年分离自韩国的Chinju99则自成一群（图2）。

3 讨论

张志等［5］对我国2011—2013年腹泻猪群的组织样品进行PEDV、TGEV和PRoV等3种常见病原学检测，发现3种导致腹泻的病原中，PEDV的阳性率最高达94" 6％。卢冰霞等［6］应用RT-PCR方法对2011 年1月至2014年4月采自广西14个不同地区的331份仔猪腹泻粪便样品进行检测，发现腹泻仔猪粪便样品中有210份为PEDV阳性，总体阳性率为63"44％。本研究调查了江苏、安徽、山东9个发生腹泻的猪场的病原流行情况，在36份腹泻样品中，PEDV阳性率为63"89％（23/36），猪场阳性率为100％（9/9），均未检出TGEV，说明猪流行性腹泻病毒广泛存在，仍然是近期我国猪群发生腹泻的主要病原。

S蛋白是PEDV重要的结构蛋白，也是主要的抗原蛋白，其核心中和抗原表位经乳酸杆菌表达或从烟草中获取的重组COE蛋白均与PEDV天然抗原具相同反应原性［7］，说明PEDV中和抗原表位在其防控和诊断中均具有重要的作用。本研究通过对猪场分离的PEDV CHNJPK2015株S蛋白中和抗原表位基因的分析，发现分离的CHNJPK2015株与2014年我国各地分离的CH/GDZQ/2014、FJ-FQ 2014、FJ-ZP 2014、PEDV-LY、PEDV-WS、PZ1406、SC1402、SH1404和疫苗株CV777序列的遗传距离较远，而与泰国2010年的分离株AVCT12的遗传距离较近。王隆柏等［8］分析了在福建省流行的猪流行性腹泻病毒S、N和ORF3的遗传变异情况，发现7株分离于2012—2013年的PEDV毒株的S和ORF3基因与2008年泰国流行株的亲缘关系比较近。以上研究说明我国流行的PEDV毒株可能来源于泰国，这一情况值得思考和研究。

［1］朱迪国，宋建德，袁丽萍，等" 2013—2014年全球猪流行性腹泻重大疫情分析［J］"中国动物检疫，2014，31（10）：42-46"

［2］Kang T J，Seo J E，Kim D H，et al" Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants［J］" Protein Expr Purif，2005，41（2）：378-383"

［3］Chang S H，Bae J L，Kang T J，et al" Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus［J］" Mol Cells，2002，14（2）：295-299"

［4］Kim S Y，Song D S，Park B K" Differential detection of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus by duplex RT-PCR ［J］" J Vet Diagn Invest，2001，13（6）：516-520"

［5］张志，董雅琴，刘爽，等"我国部分省份猪流行性腹泻的流行病学监测［J］"中国动物检疫，2014，31（10）：47-51"

［6］卢冰霞，秦毅斌，何颖，等" 2011年—2014年广西猪流行性腹泻病毒检测及其M基因的序列分析［J］"中国畜牧兽医，2015，42（3）：549-557"

［7］董丽娜，高凤山，许崇波，等"表达猪流行性腹泻病毒COE基因的重组乳酸菌的构建与鉴定［J］"畜牧兽医学报，2008，39（12）：1743-1747"

［8］王隆柏，林裕胜，车勇良，等"猪流行性腹泻病毒S、N和ORF3基因的遗传变异分析［J］"畜牧兽医学报，2014，45（11）：1830-1836"

（责任编辑：闫其涛）

Detection of porcine epidemic diarrhea virus and analysis of neutralizing antigen epitope gene of S protein

DING Wei-xing1，WANG Rong-tan1，GUO Jia-hong2，LIAO Xue-wen2，MIAO De-nian2*
（1Shanghai Ruifeng Agro-Technology Company Limited，Shanghai 201106，China；2Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China）

Abstract：Detection of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）and transmissible gastroenteritis virus （TGEV）in diarrhea samples（fresh feces and intestinal tissue，etc"）of 9 pig farms form Jiangsu，Anhui，Shandong in 2015 were conducted by RT-PCR，and the neutralizing antigen epitope gene of spike protein of isolated PEDV strain（CHNJPK2015）was cloned，sequenced and genetic evolution analyzed" The results showed that the positive rate of PEDV in 9 pig farms was 100％，the individual positive rate of PEDV was 63" 89％，no TGEV was detected，indicating that the diarrhea disease was mainly caused by PEDV this time" The tested strain and reference strains could be divided into 3 groups" The neutralizing antigen epitope gene of S protein of CHNJPK2015 and AVCT12，Br1/87，CHM2013，LZC，SM98 strains showed near genetic distance，the nucleotide sequence homology of them were 99" 5％—99" 8％，belonging to the same group" But the neutralizing antigen epitope gene of S protein of CHNJPK2015 and CH/GDZQ/2014，FJ-FQ 2014，FJ-ZP 2014，PEDV-LY，PEDV-WS，PZ1406，SC1402，SH1404，vaccine strain CV777 isolated in 2014 showed far genetic distance，the nucleotide sequence homology of them were 92" 9％—96" 2％，belonging to different groups"

Key words：Porcine epidemic diarrhea virus；Spike protein；Phylogenetic tree

*通信作者，E-mail：18918162235＠163" com

作者简介：丁卫星（1965—），男，本科，推广研究员，主要从事农业技术推广研究工作。Tel：021-62209501

基金项目：上海市科技支撑项目（13391901500）

收稿日期：2015-06-23

文章编号：1000-3924（2016）01-019-04

中图分类号：S852" 65

文献标识码：A