基因工程中的黏性末端和平末端

山西 梁晓励 蔚捷宇

基因工程中的黏性末端和平末端

山西 梁晓励 蔚捷宇

基因工程的操作中用到三种工具，其中有一种能准确切割DNA的手术刀——限制性核酸内切酶，经过限制性核酸内切酶切割后的DNA片段末端有的是黏性末端有的是平末端。

什么是黏性末端或平末端呢？

某种限制性核酸内切酶能够特异性识别双链DNA分子特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。当限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。如下图所示：

在基因工程中，经限制性核酸内切酶处理后暴露出的黏性末端或平末端，在DNA连接酶的作用下可连接起来。末端之间是如何连接的呢？

一、黏性末端之间的连接

两个黏性末端之间相连，前提条件是末端的含氮碱基之间必须依次遵循碱基互补配对原则。

【例1】假如载体被切割后，得到的黏性末端序列为，则能与该载体连接的目的基因分子的黏性末端是（ ）

【解析】选项A的黏性末端从左到右依次是TTAA，而题干中的黏性末端从左到右依次是AATT，它们的黏性末端的碱基从左到右依次都遵循碱基互补配对原则，符合黏性末端相连的条件，A正确；选项B的黏性末端从左到右依次是ATCC，而题干中的黏性末端从左到右依次是AATT，它们的黏性末端的碱基从左到右不能依次都遵循碱基互补配对原则，不符合黏性末端相连的条件，B错误；同理，C、D错误。

【答案】A

【例2】限制性核酸内切酶能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并在特定部位切割DNA分子上核苷酸之间的磷酸二酯键。下图为四种限制性核酸内切酶BamH Ⅰ，EcoR Ⅰ，Hind Ⅲ以及Bgl Ⅱ的识别序列。箭头表示每一种__限制性核酸内切酶的特定切割部位，其中哪两种限制-酶所切割出来的DNA片段末端可以互补黏合？其正确的末端互补序列为何？ （____）

A.BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ；末端互补序列—AATT—

B.BamH Ⅰ和Hind Ⅲ；末端互补序列—GATC—

C.EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ；末端互补序列—AATT—

D.BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ；末端互补序列—GATC—

【解析】BamH I识别及切割的部位和 BglⅡ识别及切割的部位切割后的黏性末端都是GATC及CTAG，正好依次互补配对，D正确。而EcoR I识别及切割的部位切割后的黏性末端是AATT 及TTAA，与BamH I识别及切割的部位切割后的黏性末端GATC及CTAG不能互补配对，A错误。同理，B和C错误。

【答案】D

二、平末端之间的连接

两个平末端之间是可以任意连接的。例如：

三、黏性末端与平末端之间的连接

如何将一个黏性末端与一个平末端相连，需要将平末端修饰成一个与该黏性末端互补配对的黏性末端，方可连接。例如：

四、基因工程末端之间连接的应用实例

【例3】下图为基因工程培养转基因马铃薯的过程及相关限制性内切酶的识别位点，识图并分析下列问题：

转基因操作流程图

几种限制酶识别序列及切割位点表：

__限制___酶___Alu______Ⅰ_____E_____ coR_Ⅰ____Pst______Ⅰ_____________Sma_Ⅰ切割位点↓AGCT TTGA _____________________↑↓GAATTC CTTAAG↑____↓CTGCAG GACGTC↑___________↓CCCGGG GGGCCC↑____

若对符合设计要求的重组质粒T进行酶切。假设所用的酶可将其识别位点完全切开，请根据图对以下酶切结果作出判断。

①采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切，得到_____种DNA片断。

②采用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切，得到_____种DNA片断。

【解析】做此题的关键是识图。从表可看出，酶AluⅠ和SmaⅠ切出的是平末端，酶EcoRⅠ和PstⅠ切出的是黏性末端，从流程图中看，对含有抗原基因的DNA片断用EcoRⅠ和AluⅠ切割，切出的末端X为黏性末端，Y为平末端，载体质粒上有三个酶切位点，但从图②看出没有用到酶PstⅠ，只用到了酶SmaⅠ和EcoRⅠ，切出的末端M为黏性末端，N为平末端，当进行基因表达载体构建形成重组质粒时，由图可看出，末端N和Y相连接，这是由于平末端之间可以任意连接，但连接后形成的核苷酸序列，不是酶AluⅠ识别和切割的序列，也不是酶SmaⅠ识别和切割的序列。末端X和M相连，而这两个末端都是酶EcoRⅠ切割的，符合黏性末端相连接的条件，连接成的核苷酸序列为，此序列仍为酶EcoRⅠ识别和切割的位点。①当用酶EcoRⅠ和PstⅠ进行酶切时，EcoRⅠ的酶切位点重新形成，PstⅠ的酶切位点一直保留，所以可从两个位置切割，切成两段。②采用EcoRⅠ和SmaⅠ进行酶切时，EcoRⅠ的酶切位点重新形成，SmaⅠ的酶切位点在重组时消失了，所以只能在一个位点进行切割，切成一段。

【答案】①2 ②1

【例4】下图表示构建表达载体时的某种质粒与目的基因。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是

据图分析，当进行基因表达载体构建时，分别用哪种酶切割质粒和目的基因？_______________________。这样做的理由是什么？____________________________。

【解析】此题意在考查学生分析问题的能力及读图能力。从题干可看出，限制酶Ⅱ识别的序列中含有限制酶Ⅰ识别的序列和切割位点，因此用限制酶Ⅰ也可将限制酶Ⅱ识别的序列识别并切割。而限制酶Ⅱ不能识别限制酶Ⅰ识别的序列，所以用限制酶Ⅱ切割质粒只能切割一个标记基因，用限制酶Ⅰ切割目的基因可将两端都切割。

【答案】用限制酶Ⅱ切割质粒，用限制酶Ⅰ切割目的基因。用限制酶Ⅱ切割质粒只能切割一个标记基因，用限制酶Ⅰ切割目的基因可将两端都切割。

（作者单位：山西省忻州师范学院附属中学）