三七总皂苷对重症急性胰腺炎大鼠的治疗作用及机制

盛国涛，李双喜，莫小华(昆明医科大学第二附属医院，昆明 650101)



三七总皂苷对重症急性胰腺炎大鼠的治疗作用及机制

盛国涛，李双喜，莫小华(昆明医科大学第二附属医院，昆明 650101)

摘要：目的观察三七总皂苷对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠的治疗作用，并探讨其机制。方法 选取SD大鼠30只，随机分为假手术组(SO组)、重症胰腺炎组(SAP组)、三七总皂苷干预组(PNS组)，每组各10只，经胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠制备大鼠SAP模型。SO组进腹后仅翻动胰腺和十二指肠后关腹，不注入5%牛磺胆酸钠，其中PNS组模型建立后立即予腹腔注射三七总皂苷50 mg/mL，SO组、SAP组建模后注射生理盐水0.1 mL/100 g。各组大鼠分别于建模后4 h检测血清淀粉酶(AMS)，光镜下观察胰腺组织病理学改变，免疫组化SP法检测胰腺组织中NF-κB及炎症因子TNF-α表达。结果与SO组相比，PNS组和SAP组大鼠血清AMS水平、胰腺组织病理学评分、NF-κB和TNF-α表达量显著升高(P均<0.05)；与SAP组相比，PNS组大鼠血清AMS水平、胰腺组织病理学评分、NF-κB和TNF-α表达量显著降低(P均<0.05)；相关性分析结果显示，胰腺组织腺泡细胞内NF-κB与TNF-α因子表达呈正相关(r分别为0.958、0.992、0.989，P均<0.05)。结论 三七总皂苷能减轻SAP的胰腺损伤，其机制可能为抑制胰腺组织NF-κB因子激活，减少炎性细胞因子过度释放。

关键词：重症急性胰腺炎；三七总皂苷；核转录因子κB；肿瘤坏死因子α

重症急性胰腺炎(SAP)在发病时除胰腺自身变化外，还会引起其他脏器功能异常，损伤胰外器官如肺、肝、肾等多种脏器，引发全身炎症反应综合征(SIRS)，甚至会发生多脏器功能衰竭(MOF)，病死率极高[1，2]，治疗棘手。目前对胰腺炎的发病机制尚无明确解释。随着国内外众多学者的深入研究，NF-κB因子过度激活被认为是炎症反应发生发展的重要核心环节，抑制其活化可能有助于降低SAP的病死率。目前中药在治疗胰腺炎方面已取得较好效果，其中三七总皂苷目前研究较多。2015年7月，我们通过建立大鼠胰腺炎模型，给予三七总皂苷进行预干预，观察三七总皂苷对SAP的治疗作用，并探究其相关机制。

1材料与方法

1.1材料实验动物：清洁级SD大鼠30只，体质量200～250 g，由昆明医科大学实验动物中心提供。主要药品与试剂：注射用三七总皂苷(血塞通注射液)购自云南植物药业有限公司；牛磺胆酸钠购自美国Sigma公司；10%水合氯醛由昆明医科大学第二附属医院病理科提供；NF-κB p65多克隆抗体购自SANTA CRUZ公司。

1.2分组、造模及干预将30只SD大鼠随机分为假手术组(SO组)、急性重症胰腺炎组(SAP组)、三七总皂苷干预组(PNS组)3组，每组10只。SAP组、PNS组动物模型使用并改良经肠壁逆行胰胆管注射法，术前禁食24 h，但不禁水。术前使用生理盐水将牛磺胆酸钠(ST)配制成5%的ST溶液，用于建模。准备好血塞通注射液。使用乙醚吸入麻醉，麻醉成功后，仰卧位固定大鼠于手术台上。腹部常规备皮、消毒、铺巾，作手术标记。取上腹部正中切口长1～2 cm，逐层入腹，翻动十二指肠寻找大鼠胰胆管，探查十二指肠乳头位置，明确胰胆管走行。辨认十二指肠降部肠管壁内潜行的胰胆管，用无损伤丝线结扎肝门处胆管，辨认出十二指肠乳头处，使用针头在其对侧肠壁穿刺后退针。用预先去尖钝针头1 mL注射器插入肠腔，探查十二指肠乳头，经十二指肠乳头逆行穿刺入胰胆管并向前推进约0.5 cm，针头使用无损伤血管夹固定。以0.2 mL/min的速度向胰胆管内注入5% ST(0.1 mL/100 g)，注射完毕后2～3 min肉眼观察确认大鼠胰腺组织水肿，颜色变为砖红色或灰白色等改变，即建模成功，拔出注射针头前解开结扎在肝门部的无损伤丝线。皮下注射生理盐水(0.1 mL/100 g)补液，逐层关腹。其中SO组模型制作：进腹后仅翻动胰腺和十二指肠后关腹，不注入5%牛磺胆酸钠；PNS组模型制作：建模方式与SAP组相同，但在关腹前使用50 g/mL血塞通注射液(0.1 mL/100 g)注入腹腔后逐层关腹。SO组及SAP组大鼠腹腔内注射等量生理盐水(0.1 mL/100 g)。在建模后4 h处死大鼠，心脏采血，经腹腔取胰腺组织标本。

1.3血清淀粉酶(AMS)检测心脏采血，采血量约5 mL。将血清离心15 min，-80 ℃下保存。采用全自动生化分析仪检测血清AMS。

1.4胰腺组织病理学评分经腹腔取胰腺组织，取大小约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm胰腺组织用10%甲醛溶液固定，送往昆明医科大学第二附属医院病理科，由病理科医师进行苏木素-伊红染色。光镜下观察并采用改良的Grewal和Schmidt等方法对SAP大鼠胰腺组织损伤进行定量评估。

1.5胰腺组织腺泡细胞内NF-κB和TNF-α表达检测 采用免疫组化SP法检测胰腺组织细胞内NF-κB和TNF-α因子表达，操作按试剂盒说明书进行。胰腺组织细胞质和细胞核或细胞膜染有棕黄色或棕褐色颗粒为阳性，结果采用图像分析软件Image pro plus进行分析，测平均光密度，通过平均光密度值反映胰腺组织内NF-κB、TNF-α表达量。

2结果

2.1三组血清AMS水平比较SO组、SAP组、PNS组血清AMS水平分别为(885.2±202.33)、(3 134.12±331.05)、(2 661.15±324.72)U/L，三组间两两比较，P均<0.05。

2.2三组胰腺组织病理学评分比较SAP组、PNS组大鼠胰腺组织均出现肿胀、渗出、点状出血坏死。SO组、SAP组、PNS组胰腺组织损伤评分分别为(2.3±0.47)、(13.1±1.35)、(6.7±1.29)分，三组间两两比较，P均<0.05。

2.3三组胰腺组织中NF-κB/p65阳性细胞、TNF-α表达比较SO组、SAP组、PNS组NF-κB /p65阳性量分别为(33.16±3.22 )、(72.20±7.76)、(47.28±3.72)Pu，TNF-α表达量分别为0.079±0.011、0.334±0.018、0.145±0.009，三组间两两比较，P均<0.05。

2.4胰腺组织腺泡细胞内NF-κB与TNF-α表达的相关性SO组、SAP组、PNS组胰腺组织腺泡细胞内NF-κB与TNF-α表达存在正相关性(r分别为0.958、0.992、0.989，P均<0.05)。

3讨论

SAP作为外科常见的急腹症，病情发展凶险，病死率较高，临床治疗棘手。造成SAP治疗瓶颈的主要原因是其发病机制复杂，目前尚未明确。研究表明，SAP在病程早期由于胰酶的大量释放，损伤胰腺细胞及小血管壁，引起多种炎症介质的释放，改变血管通透性导致胰腺水肿、出血、坏死，继而引发严重的SIRS和多器官功能不全综合征(MODS)等[3]。

“细胞因子和炎症介质”是人们在SAP研究中发现并了解较早的致病因素。大量研究表明，部分炎症介质和细胞因子在体内含量的多少与SAP病情轻重和最终病死率呈正相关。目前关于炎症学说的研究已较为成熟，大量的细胞因子和炎症介质中以TNF-α与SAP的关系最为密切。TNF-α是由机体内各种炎症细胞如T淋巴细胞、肥大细胞、巨噬细胞、单核细胞产生的。其主要作用可通过对机体免疫功能的影响，使机体肿瘤细胞受到干扰，同时还可通过调节细胞的代谢功能来影响正常细胞的生长和分化。在SAP病情发展中，TNF-α起重要作用。在对临床100例患有SAP的患者进行研究发现[4]，在患病90 d内由于各种并发症死亡的患者入院时血清TNF-α含量是死亡患者的63倍；同时发现SAP合并有MODS较单纯的SAP患者血清中TNF-α含量高出191.5倍。可见TNF-α是反映SAP严重轻度及预后情况的较好指标。TNF-α在各种炎症反应中均起到重要作用，其可破坏上皮组织的保护屏障，增加其通透性。这样可使其他炎症介质、炎症细胞通过屏障到达炎症组织，最终导致炎症反应加重，组织损伤[5]。NF-κB由Sen等[6]于1986年在B淋巴细胞核中提取并检测出来，其在SAP发病过程中对炎症的发生发展起到重要作用。在SAP反应中NF-κB可激活大量炎症因子，如肿瘤坏死因子、白细胞介素、趋化因子、黏附分子和集落刺激因子等炎症因子，可促进瀑布炎症反应[7，8]。

近年来，运用中药及天然药物治疗SAP在动物和临床实验方面均取得一定进展[9]。本实验结果显示，与SO组相比，PNS组和SAP组大鼠血清AMS水平、胰腺组织病理学评分、NF-κB和TNF-α表达量显著增高；与SAP组相比，PNS组大鼠血清AMS水平、胰腺组织病理学评分、NF-κB和TNF-α表达量显著降低；相关性分析结果显示胰腺组织腺泡细胞内NF-κB与TNF-α因子的表达呈正相关，提示三七总皂苷注射液可能通过抑制NF-κB表达，从而抑制TNF-α等炎性因子的分泌，有助于SAP的治疗。当前大量的临床观察和实验研究表明三七总皂苷在胰腺炎的治疗方面有着较显著效果。有学者[10]使用乌司他丁联合三七总皂苷治疗SAP大鼠，观察大鼠血清中TNF-α和IL-1β在组织中表达，结果发现SAP大鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-1β表达明显升高，单独三七总皂苷和乌司他丁均可抑制其表达，但以两者联用的治疗效果最为理想，说明三七总皂苷对SAP治疗效果可通过抑制炎症反应实现。

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Effect of panax notoginseng saponins in treatment of rats with severe acute pancreatitis

SHENGGuotao,LIShuangxi,MOXiaohua

(TheSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalCollege,Kunming650101,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of panax notoginseng saponins in treatment of rats with severe acute pancreatitis (SAP), and to explore the mechanism.MethodsThirty SD rats were randomly divided into three groups: sham operation group (SO group ), severe acute pancreatitis group (SAP group), PNS preconditioning group (PNS group), and there were 10 rats in each group. Rat SAP models were induced by retrograde injection of 5% taurocholic acid sodium to pancreatic duct. SO group was just treated with pancreas and duodenum turning after abdominal closure without injection of 5% taurocholic acid sodium. The rats in the PNS group were given intraperitoneal injection of 0.1 mL/100 g PNS 50 mg/mL (xuesetong injection 0.1 mL/100 g) after the models were established. And rats in the other two groups were given normal saline (0.1 mL/100 g). The serum AMS were detected at 4 hours after modeling, we observed the pathological changes of pancreatic tissues under the light microscopy. The expression of nuclear transcription factor-κB (NF-κB) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) was detected by immunohistochemical SP method.ResultsCompared with the group SO, serum AMS levels, pathology scores of pancreatic tissues and the expression of NF-κB and TNF-α were significantly increased in the groups PNS and SAP (all P<0.05), and those in the SAP group rats were significantly higher than those in the PNS group (all P<0.05). The expression of NF-κB was positively correlated with TNF-α expression in the pancreas acinar cells (r=0.958, 0.992 and 0.989, all P<0.05).ConclusionsPanax notoginseng saponins may reduce the pancreatic injuries of SAP rats. Panax notoginseng saponins may have protective effect on SAP rats by inhibiting the activation of NF-κB and reducing the excessive release of inflammatory factors.

Key words:severe acute pancreatitis; panax notoginseng saponins; nuclear transcription factor-κB; tumor necrosis factor-α

(收稿日期：2015-11-17)

中图分类号：R576

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)13-0017-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.006

通信作者简介：莫小华(1963-)，教授，主任医师，主要研究方向为胰腺疾病。E-mail:120638905@qq.com

第一作者简介：盛国涛(1989-)，在读硕士研究生，主要研究方向为肝胆胰外科学临床治疗。E-mail:1454846616@qq.com

基金项目：昆明医科大学联合专项基金资助项目(2007C138M)；昆明医科大学研究生创新基金资助项目(2015S91)。