慢性高原病患者骨髓CD71+、CD235a+有核红细胞增殖及凋亡变化

冯婷婷，冀林华，刘芳，韩园芳，任荣，胡一博，李建平，熊华，尹启超，崔森

(青海大学附属医院，西宁810001)



慢性高原病患者骨髓CD71+、CD235a+有核红细胞增殖及凋亡变化

冯婷婷，冀林华，刘芳，韩园芳，任荣，胡一博，李建平，熊华，尹启超，崔森

(青海大学附属医院，西宁810001)

目的 观察慢性高原病(CMS)患者骨髓CD71+、CD235a+有核红细胞增殖、凋亡变化。方法 提取16例CMS患者(CMS组)及16例单纯陈旧性骨折患者(对照组)骨髓单个核细胞(BMMNCs)，用免疫磁珠法分选CD71+、CD235a+有核红细胞。用CCK-8法检测骨髓CD71+、CD235a+有核红细胞增殖能力，Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术测算细胞凋亡率，集落形成实验测算骨髓CD71+、CD235a+有核红细胞及BMMNCs克隆形成率。结果 与对照组比较，CMS组骨髓CD71+、CD235a+有核红细胞增殖能力升高，凋亡率降低(P均<0.05)。培养第7、14天，两组骨髓CD71+、CD235a+有核红细胞克隆形成率比较，P均>0.05；两组BMMNCs克隆形成率比较，P均<0.05。结论 CMS患者骨髓CD71+、CD235a+有核红细胞增殖增加、凋亡减少。

高原病，慢性；CD71+有核红细胞；CD235a+有核红细胞；细胞增殖；细胞凋亡

慢性高原病(CMS)是高原常见疾病。在海拔2 500 m以上地区，机体进行自我调节以适应高原环境。但CMS是机体对高原低氧环境代偿功能失调而引起红细胞的过度积累，进而导致整个机体损害。目前有关CMS患者红细胞增殖与凋亡失衡的报道较少。2014年3月～2015年10月，本研究对16例CMS患者骨髓CD71+、CD235a+有核红细胞的增殖与凋亡情况进行检测，以进一步了解红细胞过度积累的机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本院收治的CMS患者16例(CMS组)，符合第六届国际高原医学和低氧生理学术大会的CMS诊断标准[1]。均为汉族男性，年龄(46.43±7.1)岁；血红蛋白(Hb)(224.87±10.6)g/L，动脉血氧饱和度(SaO2)(82.28±9.8)%，血细胞比容(Hct)(66.94±3.8)%。单纯陈旧性骨折患者16例作为对照组，均为汉族男性，年龄(43.61±6.1)岁；Hb(145.50±10.1)g/L，SaO2(97.26±8.7)%，Hct为(44.51±3.1)%；血象及骨髓象均正常，与健康人骨髓涂片无差别。两组居住海拔均为2 500～4 000 m；均排除感染、恶性肿瘤及其他系统系疾病。两组年龄比较差异无统计学意义。研究获得青海大学附属医院伦理委员会同意。患者知情同意。

1.2 骨髓CD71+、CD235a+有核红细胞分选 CMS组与对照组均于髂后上棘处采集骨髓液10 mL，肝素抗凝。采用密度梯度离心法提取骨髓单个核细胞(BMMNCs)，将分离好的BMMNCs制成单细胞悬液，台盼蓝染色后进行细胞计数；根据细胞计数加入CD71抗体10～20 μL，4 ℃孵育15 min后进行磁珠分选，取CD71+细胞，剩余CD71-细胞。磁珠buffer重悬CD71-细胞进行细胞计数，根据计数加入CD235a抗体，4 ℃孵育15 min后进行磁珠分选，取CD235a+细胞，将分选后的CD71+、CD235a+细胞混匀后进行细胞计数。磁珠分选后以流式细胞术进行细胞纯度分析，单次分选后纯度均在85%以上。

1.3 骨髓CD71+、CD235a+有核红细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。取分选好的CD71+、CD235a+有核红细胞按1×104/孔接种于96孔板内，37 ℃、5% CO2、3% O2、饱和湿度三气培养箱培养72 h；加CCK-8 10 μL孵育4 h，用酶标仪检测450 nm波长处吸光度值(OD值)作为骨髓CD71+、CD235a+有核红细胞生长情况。实验设3个平行孔，取平均值。

1.4 骨髓CD71+、CD235a+有核红细胞凋亡率测定 采用Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术。取分选好CD71+、CD235a+有核红细胞(1×106)，PBS洗涤2次，重悬后移入流式管，加入Annexin V-FITC 5 μL、PI 5 μL避光反应15 min后上机检测，采集10 000个细胞进行分析。Annexin V+PI-细胞为早期凋亡细胞，Annexin V+PI+细胞为晚期凋亡细胞，以二者总和计算细胞凋亡率。

1.5 骨髓CD71+、CD235a+有核红细胞、BMMNCs克隆形成率测算 采用集落形成实验。选取分选好的CD71+、CD235a+有核红细胞接种于含有0.9%甲基纤维素、30% FBS、4 mol/L 2-巯基乙醇及1%双抗的IMDM培养体系中，加入重组人促红细胞生成素(EPO)3 IU、重组人白细胞介素3 20 ng，接种于6孔板，调整细胞为1×104/孔。实验设2个复孔。孔板周围加PBS，保持湿度。于37 ℃、5%CO2、3%O2、饱和湿度三气培养箱中培养，培养第7、14天观察并计算克隆形成率。BMMNCs接种、培养同上，调整细胞为1×105/孔，培养第7天观察红细胞集落生成单位(CFU-E)数量，计算克隆形成率；培养第14天观察CFU-E及红细胞爆裂型集落生成单位(BFU-E)数量，计算克隆形成率。克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。

2 结果

2.1 两组骨髓CD71+、CD235a+有核红细胞增殖比较 CMS组、对照组OD值分别为1.037±0.276、0.499±0.158，两组比较，P<0.05。

2.2 两组骨髓CD71+、CD235a+有核红细胞凋亡率比较 CMS组、对照组CD71+、CD235a+有核红细胞凋亡率分别为(5.00±2.76)%、(14.25±11.76)%，两组比较，P<0.05。

2.3 两组骨髓CD71+、CD235a+有核红细胞克隆形成率比较 培养第7天 CMS组、对照组克隆形成率分别为(7.82±4.93)%、(4.88±3.57)%，两组比较，P>0.05。培养第14天，CMS组、对照组克隆形成率分别为(8.93±6.47)%、(6.67±3.50)%，两组比较，P>0.05。

2.4 两组BMMNCs克隆形成率比较 培养第7天，CMS组、对照组BMMNCs克隆形成率分别为(19.02±1.95)%、(15.89±4.34)%，两组比较，P<0.05。培养第14天，CMS组、对照组BMMNCs CFU-E克隆形成率分别为(22.89±3.81)%、(17.89±3.18)%，两组比较，P<0.05；CMS组、对照组BMMNCs BFU-E克隆形成率分别为(2.42±0.70)%、(1.96±0.53)%，两组比较，P<0.05。

3 讨论

CMS是近年研究的热点，对其发病机制的研究取得较大进展。细胞增殖、信号途径、造血调控因子[2]、微血管密度、肾素-血管紧张素系统、其他细胞调控因子[3～6]及细胞凋亡[7]等均对CMS的发病有一定影响。有研究发现，缺氧可能通过提高缺氧诱导因子1α(HIF-1α)及HIF-2α水平促使机体产生EPO和血管内皮生长因子(VEGF)，而EPO和VEGF可促进红细胞生成[8]。另有研究表明，CMS的发生亦与基因有关，儿童时期HIF-1α及HIF-2α基因表达高的个体，成年后在高海拔地区易发生CMS[9]。同时CMS患者亦会表现为轻度睡眠呼吸暂停和氧化应激[10]，从而加重患者的缺氧状态。CD71在红系前体细胞阶段表达较高，随着红系发育成熟，表达逐渐降低[11]；而CD235a表达与CD71的表达相反，随着红系发育成熟其表达逐渐升高[12]。CD71+、CD235a+有核红细胞可作为骨髓有核红细胞群体的代表。本研究结果显示，与对照组比较，CMS组细胞凋亡率降低，CMS组BMMNCs凋亡减少，细胞增殖比例增加，有核红细胞产生累积效应。蔡玉亮等[7]研究表明，CMS的主要发病机制与BMMNCs凋亡减少、增殖增加有关；血红蛋白与BMMNCs增殖并无明显相关性。与本研究结果相符。

CD71+、CD235a+有核红细胞属于造血干细胞所分化出来的有核红细胞，到成熟细胞分裂次数仅为3～5次，不易形成集落，仅形成集簇。进行集簇计数，在第7、14天时两者并无明显差异。采用BMMNCs进行集落培养，第7天时CFU-E、第14天时CFU-E及BFU-E克隆形成率，与对照组相比均明显增高。说明CMS组有核红细胞增殖能力增高。低氧环境可能活化了红细胞信号转导通路[13]，由于信号通路的作用而导致有核红细胞生成增加。本研究中细胞培养第7、14天时两组有核红细胞克隆形成率比较无统计学意义，这可能与有核红细胞成熟有关。在观察时部分有核红细胞已经成熟，形成成熟红细胞，无法观察集簇的形成。红细胞生成信号通路是个复杂的通路[14]，CMS组在长期缺氧的环境中可能导致数条信号通路增强，进而导致红细胞累积。提示CMS组增殖能力高于对照组。CD71+、CD235a+有核红细胞凋亡减少，亦可能与红细胞信号通路转导增强有关。

因此，CMS发生机制可能与有核红细胞的增殖与凋亡失衡有关，未来可进一步深入研究红细胞信号通路，对红细胞信号通路与CMS的关系进行进一步探究。

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基金项目：广西壮族自治区卫生厅自筹经费科研课题(Z2014146)；广西科技攻关计划项目(桂14124004-1-5)。

通信作者：何升(E-mail: 963890708@qq.com)

青海省科技厅国际合作项目(2014-HZ-808)。

冀林华(E-mail:13997244508@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.37.018

R594.3

B

1002-266X(2016)37-0056-03

2016-02-20)