他克莫司对肝移植患者外周静脉血IL-2、IL-10基因表达的影响及意义

张晓宁，王建海，鞠明艳，景亚青，李克秋，李光

(天津医科大学，天津300070)

·临床研究·

他克莫司对肝移植患者外周静脉血IL-2、IL-10基因表达的影响及意义

张晓宁，王建海，鞠明艳，景亚青，李克秋，李光

(天津医科大学，天津300070)

目的 探讨他克莫司(FK506)对肝移植患者外周静脉血IL-2、IL-10基因表达的影响及意义。方法 选择接受原位肝移植患者60例，均采用FK506+甲基强的松龙+吗替麦考酚酯三联用药治疗。肝移植术后第1、3周取外周血，检测血清ALT、AST及外周静脉血IL-2、IL-10基因表达。结果 与肝移植术后1周比较，肝移植术后3周患者血清ALT水平明显降低(P<0.05)，而血清AST水平变化不明显(P>0.05)；肝移植术后3周外周静脉血IL-2基因表达明显降低(P<0.05)，IL-10基因表达明显升高(P<0.01)。血清ALT水平与IL-2基因表达呈正相关，与IL-10基因表达呈负相关(P均<0.05)；血清AST水平与IL-2、IL-10基因表达均无相关性(P均>0.05)。结论 FK506可能通过影响外周静脉血IL-2、IL-10基因表达，从而抑制免疫排斥，诱导免疫耐受。

肝移植；他克莫司；白细胞介素2；白细胞介素10；天冬氨酸转氨酶；丙氨酸转氨酶

肝移植是临床终末期肝病最有效的治疗方式。但移植受体对供体肝的免疫排斥反应会造成一定程度的肝损伤[1]，这是影响移植肝存活的主要因素。肝移植后多种细胞因子参与受体的免疫调节过程，如Th1/Th2细胞调节因子[2]。Th1细胞可分泌IL-2，诱导T、B细胞活化增殖，参与免疫应答；Th2细胞可分泌IL-10，通过抑制IL-2的分泌阻断抗原递呈作用，进而抑制T细胞的活化[3]。两种细胞调节因子与移植物的长期存活和移植物的免疫耐受密切相关。因此，临床上必须通过使用免疫抑制剂来抑制肝移植后的免疫排斥反应。他克莫司(FK506)是从链霉菌属中分离出的发酵产物，近年来被广泛用于肝移植的免疫治疗[4]。目前对FK506的研究主要集中在其代谢过程与CYP3A5基因多态性的关系，对其药效学的研究相对较少。为此，我们进行了如下研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2013～2014年在天津市第一中心医院初次接受肝移植患者60例，男44例、女16例，年龄(53±9)岁，体质量(71.57±15.84)kg；原发病：肝癌19例，乙肝后肝硬化18例，丙肝后肝硬化9例，隐源性肝硬化10例，酒精性肝硬化1例，原发性胆汁性肝硬化3例。纳入标准：①年龄18～65岁；②初次接受原位肝移植手术；③接受FK506+甲基强的松龙+吗替麦考酚酯三联用药。排除标准：①年龄<18岁；②肝移植失败或治疗无效去世；③使用其他免疫抑制剂治疗。本研究经天津市第一中心医院伦理委员会及天津医科大学伦理委员会批准，患者或家属知情同意。

1.2 治疗方法 所有患者肝移植术后采用联合免疫抑制剂治疗：FK506+甲基强的松龙+吗替麦考酚酯。患者于肝移植术后第3天开始口服FK506，初始剂量为4 mg/d，间隔12 h服用，每日晨起服用FK506前检测血药浓度，目标血药浓度为7～10 ng/mL，根据血药浓度调整用药剂量；甲基强的松龙术后即刻一次性静脉给药1 000 mg，术后次日静脉给药量自240 mg/d起，每日减少40 mg，直至给药量为40 mg/d，之后改为口服强的松片20 mg/d；吗替麦考酚酯术前即刻一次性口服500 mg，术后次日开始口服100 mg/d。

1.3 相关指标观察

1.3.1 血清ALT、AST水平 所有研究对象肝移植术后1、3周取外周静脉血3 mL，3 000 r/min离心10 min，取血清保存备检。采用光电比色法检测血清ALT、AST。

1.3.2 外周静脉血IL-2、IL-10基因表达 采用TRIzol法抽提外周静脉血总RNA，超微量分光光度计检测RNA纯度和浓度，RNA浓度>200 ng/μL，OD260/OD280为1.8～2.2，说明提取的总RNA质量合格。采用M-MLV逆转录试剂盒将提取的总RNA逆转录为cDNA，测定cDNA的纯度和浓度，cDNA浓度>200 ng/μL，OD260/OD280为1.8～2.2，说明逆转录合成的cDNA质量合格。IL-2、IL-10基因表达检测采用Real-time PCR法。引物序列：IL-2：上游引物5′-CTGGAGCATTTACTGCTGGATT-3′，下游引物5′-GCCTTCTTGGGCATGTAAAAC-3′，PCR产物长度110 bp；IL-10：上游引物5′-CCACGCTTTCTAGCTGTTGA-3′，下游引物5′-GCTCCCTGGTTTCTCTTCCT-3′，PCR产物长度114 bp；GAPDH：上游引物5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游引物5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，PCR产物长度87 bp。PCR反应体系为10 μL：模板cDNA 2 μL，上下游引物各0.2 μL，SYBR Green荧光染料5 μL，无核酸酶水2.6 μL。PCR反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCt法计算外周静脉血IL-2、IL-10基因的相对表达量。

2 结果

2.1 肝移植术后血清ALT、AST水平变化 肝移植术后1、3周血清ALT水平分别为(135.92±22.52)、(85.88±12.55)U/L，血清AST水平分别为(38.84±4.34)、(38.77±4.60)U/L。与肝移植术后1周比较，肝移植术后3周血清ALT水平明显降低(P<0.05)，血清AST水平变化不明显(P>0.05)。

2.2 肝移植术后外周静脉血IL-2、IL-10基因表达变化 肝移植术后1、3周外周静脉血IL-2基因的相对表达量分别为1.89±1.25、1.28±1.04，IL-10基因的相对表达量分别为2.19±2.16、4.25±3.26。与肝移植术后1周比较，肝移植术后3周IL-2基因的相对表达量明显降低(P<0.05)，IL-10基因的相对表达量明显升高(P<0.01)。

2.3 血清ALT、AST与IL-2、IL-10基因表达的关系 相关性分析显示，血清ALT水平与IL-2基因表达呈正相关(r=0.412，P<0.05)，与IL-10基因表达呈负相关(r=-0.393，P<0.05)；血清AST水平与IL-2、IL-10基因表达无相关性(r分别为0.115、-0.025，P均>0.05)。

3 讨论

肝移植后受体对移植肝的免疫排斥是影响移植肝存活的主要因素。FK506是一种钙调磷酸酶抑制剂，与FK506结合蛋白结合后，可抑制钙调蛋白依赖的蛋白磷酸酶抑制活化T细胞核因子的活性，进而抑制IL-2的表达，最终发挥免疫抑制作用[5，6]。目前临床主要通过监测肝移植患者FK506血药浓度及肝功能(ALT、AST)来调整用药剂量[7]，并未深入研究肝移植患者外周血免疫因子的变化，不能准确反映患者的免疫状态。 IL-2可诱导T、B细胞活化增殖，为调控免疫应答的重要因子，具有广泛的生物学活性；IL-10是一种多功能负性调节因子，通过抑制IL-2的分泌阻断抗原递呈作用，进而抑制T细胞的活化[8]。研究表明，免疫排斥反应的发生常伴有外周静脉血IL-2基因高表达和IL-10基因低表达、甚至不表达，免疫耐受时与之相反[9～12]。二者与移植物的长期存活和移植物的免疫耐受密切相关[13～15]。本研究中，患者肝移植术后3周血清ALT水平较肝移植术后1周时显著降低，说明机体免疫排斥造成的肝损伤明显减轻，移植肝肝功能逐渐趋于稳定；肝移植术后1、3周血清AST水平均在正常范围，说明移植肝未出现明显肝损伤。因此，本研究以肝移植术后1、3周为观察点，观察了外周静脉血IL-2、IL-10基因表达。与肝移植术后1周比较，肝移植术后3周外周静脉血IL-2基因表达明显降低，而IL-10基因表达显著升高，说明FK506可抑制患者体内IL-2基因的表达，减轻免疫排斥反应；同时可增强IL-10基因的表达，诱导免疫耐受。相关性分析发现，血清ALT水平与IL-2基因表达呈正相关，与IL-10基因表达呈负相关，说明肝移植患者免疫状态可影响术后早期的肝功能；而血清AST水平与IL-2、IL-10基因表达均无相关性，说明一定程度的免疫状态改变并不会加重肝损伤。

综上所述，FK506可通过影响外周静脉血IL-2、IL-10基因表达，抑制免疫排斥反应，诱导免疫耐受。

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国家高技术研究发展技术(2012AA021003)；国家自然科学基金资助项目(21177091)。

李光(E-mail： lig@tmu.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.24.013

R392.4

B

1002-266X(2016)24-0040-03

2015-10-13)