人参抗菌蛋白的研究进展＊

王佳雯，刘美辰，张丽轩，赵大庆，赵 雨

（长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心 长春 130117）

人参抗菌蛋白的研究进展＊

王佳雯，刘美辰，张丽轩，赵大庆，赵 雨＊＊

（长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心 长春 130117）

人参是驰名中外的名贵中药材，具有较高的药用和经济价值。人参病害成为人参应用的主要制约因素。现代分子生物学的发展为人参抗病研究提供了新的手段。目前已发现的人参抗菌蛋白有脂质转运蛋白、亲环素、防御素以及PR-4和PR-10等，对人参多种致病菌均有抑制作用，为人参病害防治提供了有价值的参考。

人参 人参病害 抗菌蛋白

人参是五加科植物人参Panax ginseng C.A. Mey的干燥根和根茎，被誉为“百草之王”，被广泛用于中国传统医学（中医）和西方草药制剂，是世界上应用范围最广、使用人口最多的中药材。吉林省是中国人参的重要产地，人参的病害会直接影响人参的产量与品质。从1985年开始，科研人员开始着手开展人参病害的调查工作。目前，已被报道的人参病原菌主要有：锈腐病菌、恶疫霉、镰孢菌、人参链格孢、核盘菌、火疫霉、立枯丝核菌和腐霉；而己有记载的人参病害有40余种，其中，在中国发现的人参病害数量至少在25种以上。人参的常见病害根据发病部位可分为地上部病害、表土中病害和地下部病害。其中，地上部病害主要有黑斑病、灰霉病、疫病、炭疽病、白粉病等；表土中病害主要有猝倒病、立枯病、茎腐病等；地下部病害主要有菌核病、锈腐病、根腐病、红皮病、疫病等。如果由于田间管理不当，造成大片人参出现染病与死亡，这会直接导致参农的经济损失与人参的产量。随着对基因组学及生物信息学的研究不断深入，数据库的信息不断更新完善，植物抗病蛋白质研究成为大家关注的焦点。

植物在与外来病原菌的不断斗争中，进化出了一系列蛋白和多肽来防御寄生虫和病原菌，完善自身防御体系。这些蛋白和多肽统称为抗菌肽，迄今为止已经从植物中发现了多种抗菌蛋白[1]。其抗菌机制为在靶细胞膜上形成离子通道，使细胞膜两侧的膜电位发生改变，靶细胞因渗透压改变，水溶性物质渗出而死亡[2]。根据氨基酸序列的同源性，抗菌肽主要分为防御素、硫堇、脂质转移蛋白、亲环素、蜕皮素、类橡胶蛋白、过敏多肽、几丁质酶、葡聚糖酶和过氧化物酶等家族[3]。随着对抗菌肽结构、活性、作用机制认识的不断深化，人们对抗菌肽的关注也越来越多，如何更好的应用抗菌肽尚需要更深入的研究。

1 人参LTP蛋白

植物脂质转运蛋白（Lipid Transfer Protein，LTP）是一类碱性（pH=8.5-12）分泌型蛋白，分子量通常小于10 kDa，占植物可溶性总蛋白的4%左右[4]。该蛋白耐高温，相对化学变性、酶的消化也很稳定，在4℃条件下可存放数月。其稳定特性与LTP高度保守的结构有关：8 个半胱氨酸残基（8CM）（C-Xn-C-Xn-CC-Xn-CXC-Xn-C-Xn-C）和2 个保守的五肽 （Thr/Ser-X1-X2-Asp-Arg/lys和Pro-Tyr- X-Ile-Ser）[5]，由4个二硫键连接8个保守的半胱氨酸以稳定疏水腔的三级结构，疏水腔贯穿整个分子，并能在体外与多种疏水分子可逆性地结合，如转运脂肪酸、糖脂、乙酰辅酶A、类固醇及角质单体等。绝大多数植物LTP在N端都具有一个由 21-29个氨基酸组成的信号肽，能够穿过细胞膜进入分泌途径，分泌后定位在细胞壁[6]。

植物LTP广泛分布于植物的组织和细胞中，迄今为止，已经从数十种植物中分离纯化得到了LTP基因，例如洋葱[7]、小麦[8]、辣椒[9]、咖啡[10]和拟南芥[11]等。许多研究表明，LTP在植物的生理活动中具有重要的作用，显示出显著的抑菌功能[6，12]。

人参LTP基因包含363个碱基，编码120个氨基酸，预测分子量为12.09 kDa，理论等电点为8.63。人参LTP的氨基酸序列与向日葵、珙桐和棉花LTP的氨基酸序列相似度分别为54.2%、54.2%和54.1%。人参LTP含有8个保守的半胱氨酸，结构域模式为 C1-Xn-C2-Xn-C3C4-Xn-C5XC6-Xn-C7-Xn-C8。蛋白二级、三级结构预测结果表明，人参LTP具有LTP典型的结构，包括4个α-螺旋、4对二硫键、1个可结合和容纳脂质分子的疏水腔。构建人参LTP的系统发育树结果显示，人参LTP与莲属、椰子、咖啡和洋葱LTP序列同源性相对较高，属于I类LTP家族。使用在线软件Signalp- 4.1Signalp analysis 对LTP进行预测分析，结果显示，人参LTP的N端22个氨基酸为信号肽序列，后98个氨基酸为成熟肽。将人参LTP的cDNA插入到原核表达载体pGEX-6P1中，并使用IPTG诱导宿主菌，可发现人参LTP重组蛋白表达。通过亲和纯化方法进行包涵体纯化及复制，得到可溶的人参LTP蛋白。分别对人参的7种常见土传病真菌进行体外抑菌试验研究，结果表明，人参脂质转运蛋白在2.41 μM 和 7.23 μM的浓度下，对7种真菌菌丝的生长具有不同的抑制作用，形成抑菌圈。根据抑菌圈的大小可知，对菌核病、疫病、立枯病抑制作用较强，对根腐和锈病抑制作用相对较弱，对灰霉和黑斑无抑制作用。其中对菌核抑制作用的IC50值最低，为0.12 μM。SYTOX绿色荧光实验发现，LTP蛋白可以诱导根腐孢子膜通透性发生改变，SYTOX进入细胞内与DNA结合，观察到绿色荧光。说明人参LTP蛋白的抑菌活性是通过破坏真菌细胞膜来实现的[13]。

2 人参亲环素蛋白

亲环素是免疫超家族三个蛋白亚家族中的一个，它是一类高度保守的蛋白，他们中大多数都具有肽基脯氨酰基顺反异构酶或者旋转酶活性[14]。亲环素除了能够催化多肽和蛋白分子间酰胺键顺反异构化，还具有促进蛋白质折叠、影响细胞间相互作用的能力[15]。目前已有报道表明，亲环素参与多种细胞功能活动，包括细胞信号传导、大分子运输、细胞周期控制和应激反应[16]。

在植物中亲环素基因研究始于1990年，首次从番茄、玉米及油菜植物中提取分离得到其cDNA[17]，在后来的研究中发现亲环素基因在植物分生组织中高水平表达，并且它在植物抗胁迫及抗病虫害侵染中发挥重要作用。有关亲环素抗真菌活性的研究已有相关文献报道，从黑眼豌豆、绿豆和鹰嘴豆分离纯化的亲环素蛋白都具有抗真菌作用[18]。

人参亲环素基因的开放式阅读框包含522个碱基，编码172个氨基酸，预测等电点为 7.67，理论分子量为19.14 kDa。人参亲环素具有一个典型的PPIase区、两个保守的半胱氨酸残基（分别位于40位和168位）和一个保守的谷氨酸（83位）残基。经软件预测，人参亲环素蛋白包括6.32%的α-螺旋、21.26%的β-片层和72.42%的无规卷曲。人参亲环素在氨基酸结构上与枣亲环素的相似度最高，高达90%，在进化树的位置也最为接近。构建人参亲环素的原核表达质粒pGEX-6p-1-CyP并转化宿主菌，通过IPTG诱导及包涵体纯化获得体外重组人参亲环素蛋白。抑菌圈实验及半数抑制率实验结果说明该蛋白对人参疫霉菌菌丝的生长具有较强的抑制作用，IC50值为2.55 μM（图3）。然而，与白菜亲环素蛋白相比[19]，人参亲环素蛋白的抗菌谱较窄，这可能与其氨基酸序列有关。同时，人参亲环素蛋白与其他亲环素蛋白一样，也具有肽脯氨酰顺反异构酶活性[20]。这些结果说明重组人参亲环素蛋白有可能作为一种生物农药进行人参疫病的防治。

3 人参Defensin蛋白

植物Defensins是一类富含半胱氨酸的小分子（由45-54个氨基酸残基组成）碱性蛋白，被认为与宿主防御真菌病原体相关。植物Defensins在蛋白质一级序列上非常多变，唯一的保守性是都具有8个结构稳定的半胱氨酸残基。它们不会在人工膜上形成离子渗透孔，但是能够作用于特定的膜结合受体上，并引起Ca2+内流和K+外流，从而抑制真菌生长。同时，Defensin只能作用于新生菌丝，对于休眠孢子没有抑制能力，说明Defensin受体仅出现在真菌生命周期的较早期阶段[21-23]。

人参 Defensin 基因的开放式阅读框包含 240个碱基，编码80个氨基酸，预测蛋白分子量为 12.09 kDa。构建重组表达载体pCAMBIA1303-Defensin，通过农杆菌介导浸花法将人参Defensin 基因转入到拟南芥中，经过抗性筛选及分子鉴定获得转基因拟南芥。以野生型拟南芥做对照，分析植株对锈病菌的抗性作用。结果表明，经锈病菌胁迫5天，转基因拟南芥的生长状态明显优于野生型拟南芥，Defensin基因在转基因拟南芥中的表达量极显著高于野生型对照。说明人参Defensin对人参锈病菌具有一定的抑制作用[24]。为未来进一步研究人参Defensin的抗病机理提供了基础。同时，人参Defensin蛋白的原核表达纯化以及抑菌分析也在进行中。

4 人参病程相关蛋白-4/10（PR-4/10）

PR-4蛋白是一种几丁质结合蛋白，分子量范围为13-14.5 kDa，并分为两类。PR-4蛋白已经从包括辣椒、玉米、石榴等多种植物中被分离出来[25-28]。I类和II类PR-4蛋白都具有较强的广谱抗真菌活性。人参PR-4的cDNA首次从人参叶片中分离出来。它具有513个碱基的开放阅读框，编码170个氨基酸。人参PR-4与欧洲接骨木PR-4在氨基酸水平的同源性较高，为72%，属于II类PR-4。人参PR-4在根中的表达量较高，当遇到病原体入侵、高盐、创伤和激素压力时，其表达量会上调[29]。未来可通过转基因技术将其转至拟南芥中，进一步分析人参PR-4在植物生长及胁迫过程中的作用。

PR-10广泛存在于单子叶和双子叶植物中[30]。一些物种的PR-10具有多个同源物，其晶体结构已经被解析出来[31-33]。PR-10能够被植物激素、生物压力如真菌和细菌感染、非生物压力如高盐和低温等因素调控。人参PR-10首次报道于1997年，被认为具有核糖核酸酶活性[34]。人参PR-10具有4个亚型，即PR-10-1、PR-10-2、PR-10-3、PR-10-4。PR-10各个亚型在所有组织中均有表达但略有不同，其中PR-10-1在人参花中高表达，PR-10-2在人参根中高表达，PR-10-3和PR-10-4在人参叶片中高表达[35-38]。当存在生物胁迫或非生物胁迫时，人参PR-10的表达量均会上调。在拟南芥中过表达人参PR-10可导致植物根变长并且呈现耐盐表型，增加对假单胞菌、尖孢镰刀菌和灰霉菌等真菌的抗性。人参PR-10的4种亚型在各部位的表达水平不同，是否说明这4种亚型在人参组织发育过程中所起作用不同尚需进一步研究。同时，由于氨基酸序列的差异性，以上4种亚型在抵抗真菌侵染时的能力是否有所不同也是未来研究的方向。

5 三七抗真菌蛋白

三七与人参同为五加科的药用植物，针对三七抗真菌蛋白的研究目前也有了一些进展。三七PR-10-1基因全长863 bp，包含一个长465 bp编码155个氨基酸的开放阅读框。三七PR-10-1蛋白与人参的PR10-1同源性最高，含有Bet-v-I家族等多个保守结构域。三七PR-10-1蛋白在1-3年生三七各组织中均有本底表达，暗示其参与生长发育、代谢调控等生物学过程；PnPR10-1在根部受根腐病原菌胁迫上调表达，推测三七PR10-1基因可能参与抗三七根腐病等广谱抗病防御反应[39]。

三七PR-1基因序列长501 bp，编码166个氨基酸，与葡萄、烟草、番茄等高等植物中的PR1蛋白同源性较高。目前已经通过异源重组和蛋白表达纯化的方法获得了重组三七PR-1蛋白，为验证体外生物活性以及后期培育三七抗病品种提供了参考[40]。

6 总结

人参是中国名贵药材，享誉国际。人参的营养价值极高，但是由于较长的生长周期，阴湿的生长环境，人参在整个生长过程中常受病虫侵害，造成非常大的经济损失。目前，防治病虫害主要使用化学药品控制，一方面容易使病原体产生耐药性，另一方面农药残留也会降低人参的品质。因此，解决人参病害的问题，寻找新型的抗菌制剂，研究人参自身的抗病机制及相关蛋白是非常重要的。从人参本身入手，挖掘抗性相关基因，培育新的抗病品种，使用重组人参蛋白作为生物农药来缓解人参的病虫害问题成为了新的技术手段和途径。随着对人参蛋白研究的深入，将会有更多的人参抗菌蛋白被发现并投入到应用中来。

参考文献

1 Nawrot R, Barylski J, Nowicki G, et al. Plant antimicrobial peptides. Folia Microbiol (Praha), 2014, 59(3)：181-196.

2 Barbosa P P, Del Sart, R P, Silva O N, et al. Antibacterial peptides from plants： what they are and how they probably work. Biochem Res Int, 2011：250349.

3 Tam J P, Wang S, Wong K H, et al. Antimicrobial peptides from plants. Pharmaceuticals(Basel), 2015, 8(4)：711-757.

4 Kader J C. Lipid-Transfer Proteins in Plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1996, 47：627-654.

5 Boutrot F, Chantret N, Gautier M F. Genome-wide analysis of the rice and Arabidopsis non-specific lipid transfer protein (nsLtp) gene families and identification of wheat nsLtp genes by EST data mining. BMC Genomics, 2008, 9：86.

6 Salminen T A, Blomqvist K, Edqvist J. Lipid transfer proteins：classification, nomenclature, structure, and function. Planta, 2016, 244(5)：971-997.

7 Cammue B P, Thevissen K, Hendriks M, et al. A potent antimicrobial protein from onion seeds showing sequence homology to plant lipid transfer proteins. Plant Physiol, 1995, 109(2)：445-455.

8 Kirubakaran S I, Begum S M, Ulaganathan K, et al. Characterization of a new antifungal lipid transfer protein from wheat. Plant Physiol Biochem, 2008, 46(10)：918-927.

9 Diz M S, Carvalho A O, Ribeiro S F, et al. Characterisation, immunolocalisation and antifungal activity of a lipid transfer protein from chili pepper (Capsicum annuum) seeds with novel alpha-amylase inhibitory properties. Physiol Plant, 2011, 142(3)：233-246.

10 Zottich U, Da Cunha M, Carvalho A O, et al. Purification, biochemical and antifungal activity of a new lipid transfer protein (LTP) from Coffea canephora seedswith alpha-amylase inhibitor properties. Biochim Biophys Acta, 2011, 1810(4)：375-385.

11 Deeken R, Saupe S, Klinkenberg, et al. The nonspecific lipid transfer protein AtLtpl-4 is involved in suberin formation of arabidopsis thaliana crown galls. Plant Physiol, 2016, 172(3)：1911-1927.

12 Edstam M M, Viitanen L, Salminen T A, et al. Evolutionary history of the non-specific lipid transfer proteins. Mol Plant, 2011, 4(6)：947-964.

13 Cai K, Wang J, Wang M, et al. Molecular cloning, recombinant expression, and antifungal functional characterization of the lipid transfer protein from Panax ginseng. Biotechnol Lett, 2016, 38(7)：1229-1235.

14 Barik S. Immunophilins： for the love of proteins. Cell Mol Life Sci, 2006, 63(24)：2889-2900.

15 Vasudevan D, Gopalan G, Kumar A, et al. Plant immunophilins： a review of their structure-function relationship. Biochim Biophys Acta, 2015, 1850(10)：2145-2158.

16 Kumari S, Roy S, Singh P, et al. A cyclophilins： proteins in search of function. Plant Signal Behav, 2013, 8(1)：e22734.

17 Gasser C S, Gunning D A, Budelier K A, et al. Structure and expression of cytosolic cyclophilin/peptidyl-prolyl cis-trans isomerase of higher plants and production of active tomato cyclophilin in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A, 1990, 87(24)：9519-9523.

18 Wong J H, Ng T B, Cheung, R C, et al. Proteins with antifungal properties and other medicinal applications from plants and mushrooms. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 87(4)：1221-1235.

19 Lee J R, Park S C, Kim J Y, et al. Molecular and functional characterization of a cyclophilin with antifungal activity from Chinese cabbage. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 353(3)：672-678.

20 李帅军,才可新,张楠楠,等. 人参亲环素蛋白原核表达及其抗真菌活性. 长春中医药大学学报, 2016, 3：464-466.

21 Vriens K, Cammue B P, Thevissen K. Antifungal plant defensins：mechanisms of action and production. Molecules, 2014, 19(8)：12280-12303.

22 Lacerda A F, Vasconcelos E A, Pelegrini P B, et al. Antifungal defensins and their role in plant defense. Front Microbiol, 2014,5：116.

23 De Lucca A J, Jacks T J, Broekaert W J. Fungicidal and binding properties of three plant peptides. Mycopathologia, 1998, 144(2)：87-91.

24 李宏灵,张楠楠,王思明,等. 人参Defensin基因表达载体构建及对锈病抗性分析. 吉林农业大学学报, 2016, 4：405-409.

25 Guevara-Morato M A, de Lacoba M G, Garcia-Luque I, et al. Characterization of a pathogenesis-related protein 4 (PR-4) induced in Capsicum chinense L3 plants with dual RNase and DNase activities. J Exp Bot, 2010, 61(12)：3259-3271.

26 Bravo J M, Campo S, Murillo I, et al. Fungus- and wound-induced accumulation of mRNA containing a class II chitinase of the pathogenesis-related protein 4 (PR-4) family of maize. Plant Mol Biol, 2003, 52(4)：745-759.

27 Buyuktiryaki B, Bartolome B, Sahiner U M, et al. Pomegranate allergy and pathogenesis-related protein 4. Ann Allergy Asthma Immunol, 2013, 111(3)：231-232.

28 Lu H C, Lin J H, Chua A C, et al. Cloning and expression of pathogenesis-related protein 4 from jelly fig (Ficus awkeotsang Makino) achenes associated with ribonuclease, chitinase and anti-fungal activities. Plant Physiol Biochem, 2012, 56：1-13.

29 Kim Y J, Lee H J, Jang M G, et al. Cloning and characterization of pathogenesis-related protein 4 gene from panax ginseng. Russian Journal of Plant Physiology, 2014, 61(5)：664-671.

30 Xie Y R, Chen Z Y, Brown R, et al. Expression and functional characterization of two pathogenesis-related protein 10 genes from Zea mays. J Plant Physiol, 2010, 167(2)：121-130.

31 Mirza O, Henriksen A, Ipsen H, et al. Dominant epitopes and allergic cross-reactivity：complex formation between a Fab fragment of a monoclonal murine IgG antibody and the major allergen from birch pollen Bet v 1. J Immunol, 2000, 165(1)：331-338.

32 Neudecker P, Schweimer K, Nerkamp J, et al. Allergic cross-reactivitymade visible：solution structure of the major cherry allergen Pru av 1. J Biol Chem, 2001, 276(25)：22756-22763.

33 Biesiadka J, Bujacz G, Sikorski M M, et al. Crystal structures of two homologous pathogenesis-related proteins from yellow lupine. J Mol Biol, 2002, 319：1223-1234.

34 Moiseyev G P, Fedoreyeva L I, Zhuravlev Y N, et al. Primary structures of two ribonucleases from ginseng calluses. New members of the PR-10 family of intracellular pathogenesis-related plant proteins. FEBS Lett, 1997, 407(2)：207-210.

35 Lee O R, Pulla R K, Kim Y J, et al. Expression and stress tolerance of PR10 genes from Panax ginseng C. A. Meyer. Mol Biol Rep, 2012, 39(3)：2365-2374.

36 Lee O R, Kim Y J, Balusamy S R, et al. Expression of the ginseng PgPR10-1 in Arabidopsis confers resistance against fungal and bacterial infection. Gene, 2012, 506(1)：85-92.

37 Han J H, Lee J H, Lee O R. Leaf-specific pathogenesis-related 10 homolog, PgPR-10.3, shows in silico binding affinity with several biologically important molecules. J Ginseng Res, 2015, 39(4)：406-413.

38 Kim Y J, Jang M G, Lee H J, et al. Functional characterization of the pathogenesis-related protein family 10 gene, PgPR10-4, from Panax ginseng in response to environmental stresses. Plant Cell Tiss Organ Cult, 2014, 118(3)：531-543.

39 Li R B, Cui X M, Liu Y Z, et al. Cloning and expression analysis of pathogenesis-related protein 1 gene of Panax notoginseng. Yao Xue Xue Bao, 2014, 49(1)：124-130.

40 Tang M Q, Min D D, Li G, et al. Cloning and functional characterization of pathogenesis-related PR10-1 gene in Panax notoginseng. Yao Xue Xue Bao, 2015, 50(2)：227-232.

A Research Progress on the Antimicrobial Proteins of Ginseng

Wang Jiawen, Liu Meichen, Zhang Lixuan, Zhao Daqing, Zhao Yu
(Traditional Chinese Medicine and Biotechnology Research and Development Center, Changchun University of Traditional Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

Panax ginseng is a precious medicinal herb both in China and abroad with high medicinal and economic value. Ginseng disease has been recognized as the main factor restricting its application. Modern molecular biology for the disease resistance of ginseng promoted the development of new methods. In this study, it was found that the antimicrobial proteins of ginseng involved lipid transfer protein, cyclophilin, defensins, PR-4 and PR-10, showing inhibitory effects on various pathogens. These findings provided a reference for the control of ginseng diseases.

Ginseng, ginseng disease, antimicrobial protein

10.11842/wst.2016.11.020

R931.2

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-11-07

修回日期：2016-11-20

＊ 吉林省省级经济结构战略调整引导资金专项项目（2014N155）吉林省中药组学工程实验室，负责人：赵雨。

＊＊ 通讯作者：赵雨，研究员，主要研究方向：中药有效成分应用与开发研究。