细胞培养无菌技术及有效控制污染的措施

周梦怡，勇强，徐莉

（1、南京林业大学 现代分析测试中心，江苏 南京210037；2、南京林业大学 化学工程学院，江苏 南京210037）

细胞培养无菌技术及有效控制污染的措施

周梦怡1，勇强2，徐莉1

（1、南京林业大学 现代分析测试中心，江苏 南京210037；2、南京林业大学 化学工程学院，江苏 南京210037）

细胞培养技术是分子生物学研究中的重要手段，现已广泛应用于生物学、医学等多个领域。而无菌技术又是细胞培养技术中的关键性技术。简要地介绍细胞培养时常见的污染物，并结合在实际工作中总结出来的经验，着重讨论污染途径及对应的有效控制措施，为细胞培养操作者提供参考。

细胞培养；无菌技术；污染

为了避开正常体内自体调节以及实验应激所可能产生的机体整体因素的影响，在20世纪初，出现了一种研究动物细胞的方法——组织培养［1］。组织培养包括了器官培养和细胞培养。特别是细胞培养，自20世纪后半叶开始，在生物学、医学等多个领域，发挥出了日益重要的作用［2，3］。

细胞培养是指经酶的、机械的或化学的方法将组织或原代外植块的细胞分散开来，使呈细胞悬液，然后将其培养于固体基质上贴壁生长，或使其在培养基中悬浮生长［4］。由于细胞是在模拟体内生理环境等特定的体外条件下进行生长，缺乏机体的免疫系统等机制，因此细胞培养工作除了需要完善的实验设计和技术方法外，成败的关键还在于能否保持无菌状态、战胜多种来源污染的挑战。这就要求细胞培养操作者不仅要清楚细胞培养时潜在的污染物，还要掌握对应的控制措施。

1　污染物［5-7］

细胞培养时可能的主要污染源有三类：化学污染、细胞交叉污染和微生物污染。化学污染在细胞培养过程中发生率低。同一时期内进行多种细胞培养时可能会出现细胞交叉污染的情况，造成培养的细胞不纯。微生物则是细胞培养时最常见的污染物。如何有效的控制微生物污染，是细胞培养的重要问题。造成细胞污染的常见微生物种类有细菌、真菌和支原体。

1.1细菌污染细菌是一种原核细胞微生物，常见的细菌污染主要由大肠埃希菌、枯草杆菌、假单胞菌、葡萄球菌等引起。通常在发生细菌污染后，培养基会变浑浊，pH会变低，细胞的生长被抑制，甚至死亡。在10×物镜下可观察到细胞间的空隙有点状颗粒。

1.2真菌污染真菌是一种真核细胞微生物，个体比细菌大。污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。被真菌污染后，培养基pH会发生改变，表面可出现肉眼可见的、白色或浅黄色漂浮物。在光学显微镜下可观察到细胞间有纵横交错的丝状或树枝状菌丝。被酵母菌污染后，培养液亦会发生浑浊，但pH变化不大，酵母菌呈独立的圆形或卵形颗粒，分散在细胞周围生长。被念珠菌污染的培养液则依然清亮，念珠菌呈链状生长。真菌喜温暖潮湿的环境，故细胞培养箱、水浴锅等系统都是真菌生长的温床，是潜在的污染途径。

1.3支原体污染支原体，曾被称为类胸膜肺炎微生物，是为目前发现的最小、最简单的原核生物。支原体没有固定的形态，多呈球形。支原体没有细胞壁，通过吸取宿主的营养物和甾醇类物质进行生长和维持细胞形态。支原体污染是一个困扰大多数实验室的问题。支原体的大小为0.1～0.3μm，光学显微镜下不易观察到，可穿过绝大部分的滤膜，并且因其没有细胞壁，作用于细胞壁的抗生素对它无效。支原体生长缓慢，培养基无特殊的外在表现，但它对宿主细胞的表达、功能、生长、胞内细胞器、代谢等方面都会产生深远影响［8］。在培养过程中若发现细胞增殖减慢、饱和密度下降或发生破碎时，可怀疑是支原体的污染。

2　污染途径及对应的控制措施

细胞一旦发生污染，不仅影响实验结果，而且浪费人力、物力和时间。保持无菌，无论对于新人还是老手，都是一个巨大的挑战。体外培养的细胞缺乏免疫系统，自体不能清除污染物，因此控制污染的最佳方式就是预防污染。

结合文献报道［4，9-13］和本人的实际经验认为，在细胞培养过程中，潜在的污染途径主要包括操作技术和环境，其中环境因素又包括了无菌试剂和材料、层流超净工作台、恒温恒湿培养箱、水浴锅和冰箱等。

2.1操作技术如果培养环境洁净，那么污染会因操作者的技术问题而出现。

2.1.1培养操作前⑴个人卫生：进入细胞培养室时应更换实验室专用鞋或者穿鞋套；穿戴实验服、口罩和手套，用消毒酒精（75%浓度的乙醇）擦拭双手；如果操作者是长发，应扎于脑后。⑵工作台准备：提前0.5～1h打开超净台的紫外灯进行消毒；用蘸有消毒酒精的纸巾擦拭超净台的台面、挡板等。⑶试剂准备：从冷藏室或冷冻室取出所需的培养基等试剂，于37°C水浴锅中进行加热；加热后用消毒酒精擦拭瓶身，并立马放入超净工作台内。须注意的事项有：外套、书包等物品，易附着丰富的微生物，不应带入细胞房。

2.1.2培养操作中⑴台面布置：按实验需要和个人习惯，合理放置试剂、耗材、仪器等物品；点燃酒精灯后开始实验操作。⑵操作：靠近火焰进行实验操作；试剂瓶经火焰旋转灼烧后打开；挑选吸管，快速的纵向在火焰上来回移动并做180°旋转；将试剂瓶向吸管倾斜，吸出所需的液体量；灼烧瓶颈后，重新盖上盖子；等所有操作完毕后，拧紧瓶盖。

须注意的事项有：操作要准确、敏捷、有序；吸取溶液时，应专管专用，避免交叉污染；吸管管口要向下倾斜，以防止液体倒流进入移液器内发生污染；尽量减少细胞和培养基的敞口时间；已开口的试剂瓶尽可能的倾斜放置，防止下落微生物的污染；避免在敞口的细胞培养皿及培养皿盖上方操作；不要面对工作台或细胞培养箱讲话或咳嗽，防止口腔微生物随唾沫飞入而发生污染；若发生外溢，用蘸有消毒酒精的棉球及时擦去。

2.1.3培养操作后⑴整理：将试剂放回原来的存储位置；整理工作台面，物归原位，合理丢弃废液和废物。⑵消毒：用消毒酒精擦拭台面；打开超净工作台和细胞房的紫外灯，照射1～2h。

须注意的事项有：紫外灯开启后，人不能进入，紫外线对眼睛和裸露的皮肤均有危害，若要进入，一定要先关闭紫外灯，待人离开后打开。

2.2环境如果操作者技术水平很高，且操作严谨，那么当环境恶化时，也会导致污染风险的增加。进行细胞培养时，环境必须洁净。

2.2.1无菌试剂和材料正规途径购买的商业化的试剂（包括培养基、胰酶等）已经过了严格的质量控制，可直接进行使用。有些实验室为了防止细胞培养过程中细菌污染的发生，会在培养基中添加一定量的抗生素，例如青链霉素。抗生素的使用，在一定程度上可以有效的抑制细菌。但必须要意识到，抗生素会影响细胞的生化反应和分化［14］；同时一些隐藏的污染物也会因为抗生素的存在而不能被检测出，时间久了发生慢性污染。所以应避免对抗生素的依赖。试剂的瓶子外表面直接与空气接触，不是无菌的，所以在放入超净工作台前，要用消毒酒精进行外表面消毒。

常用的细胞培养器皿，包括培养瓶、培养皿、多孔培养板，出厂时已做过无菌处理，可直接使用。但是一些未标注无菌的材料，如吸管、离心管或玻璃瓶等，要经过严格的高压湿热灭菌（121°C，100kPa，30min），才能放入工作台中进行使用。

细胞培养过程中涉及到的自行配制的溶液要经过高压湿热灭菌（如水、磷酸盐缓冲溶液等）或0.22μm无菌滤膜过滤（不耐高温的溶液）、并检测确认为无菌后，方可使用。

2.2.2层流超净工作台层流根据风的流向，分为水平式和垂直式两种。层流超净工作台，一方面通过持续、稳定的过滤气流吹过工作台面，为细胞培养创造出可靠的无菌环境；另一方面保护操作者，降低生物危害。但是如果层流超净工作台使用不当，它将成为一个污染途径。台面上放置了过多的设备和材料，层流被破坏，失去了操作者和细胞房之间的保护边界层，从而导致有菌空气进入操作台内。清洁过程中马虎大意，将纸巾、棉球等物品掉入到工作台面下面，落在初滤器上，妨碍气流。

保证层流超净工作台有效性的措施有：①不将工作台当做储物柜使用，应有序摆放必须的设备和材料，保护层流，减少卫生死角；②操作动作温柔，保护层流的稳定性；③定期检查工作台面下方和周边缝隙，清理掉落物品，并用消毒酒精进行擦洗；④由有资质的工程师定期进行层流超净工作台的维护工作，检测过滤器、管道系统、外壳和封闭度，并进行有必要的滤器更换。

2.2.3恒温恒湿培养箱细胞污染一个主要的途径就是恒温恒湿培养箱。恒温恒湿培养箱，在培养细胞取出和放入的过程中，直接与空气接触，微生物会被夹带进入；加之其内部湿度高、温度适宜，特别有利于真菌繁殖。除非使用开放式的培养容器，否则并不需要高湿度。亦可采用基于Hanks溶液的培养基培养细胞，避免对CO2气体交换的需要。使用透气瓶盖的培养瓶，也可进一步降低因气体交换而产生污染的风险。

细胞培养瓶或培养皿，如果接触了操作台以外的地方，在放入培养箱前须经消毒酒精擦拭。但须注意的是，消毒酒精要经操作台吹干，否则会导致培养箱内乙醇浓度升高，可达5mM。研究发现，该浓度酒精会影响细胞的正常功能［15］。

在很多情况下，细胞培养必须使用恒温恒湿培养箱。为了有效的控制该污染途径，可采取的措施有：①在加湿托盘内添加真菌抑制剂，如硫酸铜、十二烷基磺酸钠，可抑制托盘内真菌的生长；亦或盛装无菌的去离子水，并每周进行更换，托盘用消毒酒精或高温灭菌的方法进行严格的清洁；②使用无毒抗真菌清洁剂对培养箱内外进行定期清洁，先用清洁剂、再用消毒酒精进行擦拭；为不留死角，清洁前应将培养箱内部能拆卸的部件都拆卸下来，清洁时也特别要注意不能拆卸的犄角旮旯处；③不正确的使用空气过滤器，那将变为培养箱一个可怕的污染途径，故须按使用说明定期更换空气过滤器；④在使用过程中，任何溢出液必须立刻用消毒酒精清除干净；⑤一旦发些培养物被污染，立马清走。

2.2.4水浴锅水浴锅在细胞培养过程中起解冻溶液、加热培养基之用。不与细胞直接接触，故很容易被忽视。殊不知，温暖而潮湿的环境，它也非常适合真菌的生长。如果仔细观察就会发现，一段时间后水浴锅的水就会变浑浊。隐藏在这的真菌会通过附着在加热的瓶身上进入到细胞房内。要控制这个污染途径，方法有：①定期更换水浴锅的水并清洗内部，可添加真菌抑制剂来延长更换周期；②瓶子在加热时，注意瓶口不接触到水，可用锡箔纸包裹瓶口和瓶颈；③瓶子加热后，先擦干水、再用含消毒酒精的纸巾擦拭后，放入操作台内。

2.2.5冰箱冰箱也是一个被忽视的污染途径。在细胞培养过程中，会用到各种各样的试剂，它们都有对应的储存条件。例如，培养基、磷酸盐缓冲溶液等存储在4°C环境内，胰酶、血清、抗生素等存储在-20°C环境内。每次打开门时，潮湿的空气进入后冷凝，造成潮湿的环境，这可导致冰箱内壁累积真菌而产生污染的风险。同时，潮湿的空气还会提高存放其内的瓶身上真菌孢子沉积的几率。有效的控制方式有：①定期清洁冷藏库，包括内壁、支架，先用清洁剂，再用消毒酒精；②用锡箔纸包裹瓶盖和瓶颈后储存。

3　结束语

如何保持无菌，是每个细胞培养实验室一直面对的难题。污染几率增加的主要原因包括：操作技术不严格，试剂质量不达标，大气中孢子计数增加，培养箱或操作台使用和维护不当，污染了的冰箱和水浴锅。因此，在细胞培养过程中，操作者不仅要严格遵守标准的操作程序，同时还要特别注意新产品、新品牌、以及设备的清洁维护。

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R446.5

A

1674-1129（2016）04-0477-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.04.020

江苏省高校自然科学研究面上项目（编号：15KJB530009）

（2016-02-25；

2016-04-28）