星点设计-效应面法优化精白雾化吸入液提取工艺

杜 阳， 夏新华*， 贺兰芝， 曾建国， 刘艳科

（1.湖南中医药大学药学院，湖南长沙410208；2.长沙市中心医院，湖南长沙410004）



星点设计-效应面法优化精白雾化吸入液提取工艺

杜 阳1， 夏新华1*， 贺兰芝1， 曾建国2， 刘艳科2

（1.湖南中医药大学药学院，湖南长沙410208；2.长沙市中心医院，湖南长沙410004）

摘要：目的 用星点设计-效应面法优选精白雾化吸入液的最佳提取工艺。方法 在单因素试验的基础上，以浸泡时间、加水量、提取时间为自变量，以多糖提取率和浸膏提取率的综合评分为评价指标，用效应面法选择最佳提取工艺。结果 确定精白雾化吸入液的最佳提取工艺为加水浸泡1.5 h，回流提取2次，加水量分别为10、8倍，提取时间分别为2.5、2.0 h。结论 星点设计-效应面法优选出的提取工艺简单、稳定，预测性良好，可为精白雾化吸入液的工业化生产提供实验依据。

关键词：精白雾化吸入液；多糖；浸膏；星点设计-效应面法；提取工艺

精白雾化吸入液由黄精、白及两味中药组成，具有益肺、杀虫、化瘀新生之功效，临床以雾化吸入方式给药，对治疗肺结核具有一定疗效。方中黄精、白及所含多糖为本制剂的主要活性成分，其药理作用已有大量文献报道［1 -3］，具有增强免疫力、抗衰老、抗炎、抗菌、抗病毒等作用。为提高本制剂的质量，确保临床治疗效果，本实验根据多糖的性质，采用水煎煮法进行提取，并以多糖提取率和浸膏提取率的综合评分为指标，用星点设计-效应面法对提取工艺进行了优选。

1 材料

1.1 仪器与设备 TU-1901型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；DK-98 -Ⅱ型水浴锅、98 -1 -B型电子调温电热套（天津市泰勒特仪器有限公司）；SHZ-Ⅲ型循环水式真空泵、RE-52型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；DZF-6020AB型真空干燥箱（北京中兴伟业仪器有限公司）；YD601N型电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）。

1.2 试药 无水葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院，批号110833-201205）。黄精、白及（湖南三湘中药饮片有限公司）。水为蒸馏水；所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 多糖得率的测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取无水葡萄糖对照品33.6 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密量取提取液1 mL，加无水乙醇5 mL，摇匀，离心30 min（转速3 500 r/min），沉淀加水溶解，置于50 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 标准曲线的建立 精密量取葡萄糖对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分别置于10 mL具塞刻度试管中，加蒸馏水至2 mL，摇匀，在冰浴中缓慢滴加0.2％蒽酮-硫酸溶液至刻度，混匀，放冷后置沸水中水浴10 min，取出，立即置冰水浴中冷却至室温，取出，以相应试剂为空白，按照紫外可见分光光度法，在502 nm波长处测定吸光度。以吸光度对浓度进行线性回归，得回归方程Y=0.044 2X+0.055 6（R2=0.999 4），表明无水葡萄糖在3.36～20.16 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.4 精密度试验 精密量取对照品溶液0.5 mL，置于10 mL具塞刻度试管中，按“2.1.3”项下方法测定其吸光度，连续测定6次。结果，RSD为0.22％，表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 精密量取供试品溶液0.5 mL，置于10 mL具塞刻度试管中，按“2.1.3”项下方法，在室温下每隔15 min测定1次光密度，从0 h开始，连续测定6次。结果，RSD为0.95％，表明供试品溶液在1.5 h内稳定性良好。

2.1.6 重复性试验 精密量取6份同批供试品溶液，每份0.5 mL，分别置于10 mL具塞刻度试管中，按“2.1.3”项下方法分别测定其吸光度。结果，RSD为1.67％，表明重复性良好。

2.1.7 加样回收率 精密量取6份含有量已知的同批供试品溶液，每份0.5 mL，分别精密加入质量浓度为66.73 μg/mL的葡萄糖对照品溶液0.5 mL，混匀按“2.1.3”项下方法分别测定其光密度。结果，平均回收率为107.2％，RSD为1.93％。

2.1.8 总多糖得率的测定 精密量取供试品溶液0.5 mL，置于10 m L具塞试管中，按“2.1.3“项下方法测定光密度，计算多糖得率。

2.2 浸膏得率的测定 精密量取水提液25 mL，置于恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃下干燥3 h，转移至干燥器中，冷却30 min，迅速精密称定重量，计算浸膏得率。

2.3 综合评分的计算 采用加权平分法，按多糖得率与浸膏得率的权重比（8∶2）计算综合评分，综合评分=［（多糖得率/最大多糖得率）×0.8 +（浸膏得率/最大浸膏得率）×0.2］×100。

2.4 单因素试验

2.4.1 浸泡时间考察 取黄精、白及各25 g，共5份，加入10倍量水，分别浸泡0、0.5、1、1.5、2 h，回流提取2 h，提取1次，收集提取液，按上述方法分别测定多糖得率与浸膏得率，结果见图1。

图1　浸泡时间的考察

2.4.2 加水量考察 取黄精、白及各25 g，共5份，浸泡时间均为1 h，提取2次，加水量分别为6（4，2）、10 （6，4）、14（8，6）、18（10，8）、22（12，10）倍，提取时间为3.5（2，1.5）h，收集提取液，按上述方法分别测定多糖得率与浸膏得率，结果见图2。

图2　加水量的考察

2.4.3 提取时间考察 取黄精、白及各25 g，共5份，加水浸泡1 h，提取2次，加水量为14（8，6）倍，提取时间分别为1.5（1，0.5）、2.5（1.5，1）、3.5（2，1.5）、4.5（2.5，2）、5.5（3，2.5）h，收集提取液，按上述方法分别测定多糖得率与浸膏得率，结果见图3。

图3　提取时间的考察

2.5 星点设计-效应面法优选

2.5.1 试验设计［4-6］在单因素试验基础上，以浸泡时间、加水量、提取时间为考察因素，每个因素设计五个水平进行星点设计试验，以综合评分为指标进行工艺优选。因素水平见表1，试验安排及结果见表2。

表1　精白雾化吸入液提取工艺星点设计-效应面法因素水平表

表2　精白雾化吸入液提取工艺星点设计-效应面法设计及结果

2.5.2 模型拟合 运用Design-Expert 7.0软件，以综合评分为因变量（Y）对各因素进行多元回归和二项式拟合，所得多元线性方程为Y=74.79 +4.40A+2.52B+12.02C （P＜0.05，R2=0.792 6）；多元二项式拟合方程为Y= 78.19 +4.40A+2.52B+12.02C-1.02AB+4.81AC-0.36BC-3.97A2+0.13B2-1.06C2（P＜0.01，R2= 0.943 9）。由两种模型的R2可知，多元二项式模型拟合的效果优于多元线性回归模型，方差分析见表3。

表3　效应面二次模型方差分析

由表3可知，各因素对提取工艺影响的大小顺序为C＞A＞B。其中，C（提取时间）和A（浸泡时间）的二次项A2影响极显著（P＜0.01），交互因素AC影响显著，而因素B、交互因素AB与BC、二次项B2与C2均无显著性影响。

2.5.3 工艺优选与预测 Design-Expert 7.0软件处理，各因素对提取工艺的影响见图4～6。由图可知，综合评分较高的提取工艺区间A为0.42～1.58 h，B为9.38～18.62倍，C为2.35～4.65 h，然后在以上区间内的效应值中选择极大值，所得最佳提取工艺参数为浸泡时间1.58 h，加水量18.62倍，提取时间4.65 h。根据二次回归模型方程所得理论值，得到多糖得率11.95％，浸膏得率38.20％，综合评分95.57。

考虑到生产实际和操作，将上述优选工艺条件修正为加水浸泡1.5 h，回流提取2次，加水量分别为10、8倍，提取时间分别为2.5、2 h。

2.5.4 验证试验 根据以上优选的工艺条件，取黄精、白及各25 g，共3份，进行最优工艺验证试验，并对试验结果取平均值，然后与拟合方程的预测值进行比较。结果，实测值与预测值相近，表明上述预测模型拟合度良好，见表4。

表4　3批样品最佳工艺验证试验

图4　浸泡时间与加水量对提取的影响

图5　浸泡时间与提取时间对提取的影响

图6　加水量与提取时间对提取的影响

2.6 提取次数的考察 在上述星点验证试验提取2次的基础上，取药渣加8倍量水，进行第3次提取，提取时间为2.0 h，将药液定容至500 mL，分别测定总多糖含有量和浸膏得率，并计算综合评分。结果表明，第3次提取液中各指标值占3次提取液各指标值总和的百分比均＜10％。因此，从降低生产成本角度考虑，确定以提取2次为宜。

3 讨论

方中黄精、白及均含有大量多糖，具有免疫增强作用［7］，能加快肺结核的痊愈过程。同时，当多糖浓度达到15～20 mg/mL时，抑菌效果甚至优于50 ppm的链霉素［8-9］，故本实验以多糖得率为评价指标具有一定合理性。

星点设计是国外常用的实验设计方法，近年来国内也有将其用于优化处方或成型工艺的报道［10-14］。本实验在进行星点设计之前，对拟考察的因素进行了单因素试验，其结果可为星点设计中各因素水平中心点与极值点（试验范围）的确定提供实验依据，避免因盲目选择试验点造成试验区域远离较优区，导致试验设计不能达到优化工艺条件的目的，同时也避免了因试验失败造成的各种损失。在星点设计中，各因素的中心点一般可结合专业知识，选择单因素试验中效应值最大的点（水平）或其相近的点，这将有助于提高试验模型预测的准确度。

星点设计是一种新型的试验设计方法，在药学应用上成效显著。与国内运用广泛的均匀设计和正交设计相比，它是通过非线性模型拟合来得出最佳条件，具有试验精度高、预测性好等特点［15］。本实验进行了6次中心点重复试验，较好地保证了精度，同时根据二次回归模型方程，得到的理论值分别为多糖得率11.95％，浸膏得率38.20％，综合评分95.57。然后按照模型优选出的最佳工艺进行了验证试验，将结果与理论值比较，发现偏差为3.42％，说明该模型预测性良好。

另外，通过方差分析和三维效应面图，可以直观看出各因素间的交互作用以及其影响药材浸出效果的规律，有助于选择试验的最优方案。

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*通信作者：夏新华（1962—），男，博士，教授，博士生导师，从事中药新制剂、新剂型、新技术及制剂质量标准的研究。Te1：（0731）88458305，E-mai1：xiaxinhua001@163.com

作者简介：杜 阳（1987—），女，硕士生，从事中药新制剂及制剂质量标准的研究。Te1：18975895818，E-mai1：328540252@qq.com

基金项目：国家科技重大专项（2013ZX10005004 -003 -001）

收稿日期：2014-09-23

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.044

中图分类号：R284.2

文献标志码：B

文章编号：1001-1528（2016）01-0184-04

网络出版日期：2015-03-18

网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20150318.0952.001.htm1