天山雪莲细胞培养物对RANKL诱导破骨细胞的影响

王 南， 唐 琴， 姬芳玲， 窦 佳， 包永明*

（1.大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁大连116024；2.大连市药品检验所，辽宁大连116029）



天山雪莲细胞培养物对RANKL诱导破骨细胞的影响

王 南1， 唐 琴1， 姬芳玲1， 窦 佳2*， 包永明1*

（1.大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁大连116024；2.大连市药品检验所，辽宁大连116029）

摘要：目的 研究天山雪莲细胞培养物对破骨细胞形成以及成熟破骨细胞活性的影响。方法 小鼠巨噬细胞RAW264.7在核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导下形成破骨细胞，诱导过程中加入天山雪莲细胞培养物（以天山雪莲总黄酮计算），通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）和Hoechst33342染色观察破骨细胞形成，以对硝基苯磷酸酯作底物检测TRAP活性；对诱导形成的破骨细胞进行乳酸脱氢酶（LDH）活性检测和Annexin V-PI双染流式细胞术进行细胞凋亡检测，RT-PCR检测Trap和基质金属蛋白酶（Mmp9）mRNA的表达。结果 天山雪莲细胞培养物能够显著抑制破骨细胞的形成以及TRAP酶活；天山雪莲总黄酮小于125 μg/mL时，对破骨前体细胞RAW264.7无细胞毒性，但会破坏成熟破骨细胞细胞膜，显著提高胞外LDH酶活性，并诱导破骨细胞凋亡；62.5 μg/mL天山雪莲总黄酮会显著下调破骨细胞的标志物Trap和Mmp9 mRNA表达。结论 天山雪莲细胞培养物对破骨细胞形成有抑制作用，并能破坏已形成的破骨细胞，降低骨吸收活性。

关键词：天山雪莲；细胞培养物；破骨细胞；抗酒石酸酸性磷酸酶；基质金属蛋白酶-9；细胞凋亡

包永明（1963—），男，博士，教授，博士生导师，研究方向为蛋白质及酶工程、生物催化与转化、药物化学及药理。Te1：（0411）84706344，E-mai1：biosci@d1ut.edu.cn

雪莲（Saussurea involucrata）已经被列为国家二级濒危植物，是西藏、新疆等高原寒带地区常用的民族药和民间药。具有活血通经、散寒除湿、强筋骨、温肾助阳、调节体液异常等功效。利用细胞培养技术，提高雪莲中药效成分的量，具有周期短、不受季节和气候等自然条件限制的优点，是解决自然资源不足的理想方法［1］。

破骨细胞（osteoc1asts，OC）是人体生理性骨重建和病理性骨破坏过程中高度特异性的唯一具有骨质吸收功能的多核巨细胞，在骨质疏松等疾病的研究中起关键作用［2-3］。破骨细胞属于终末细胞，不能分化传代，分离纯化困难。将破骨细胞前体定向诱导为破骨细胞是目前较理想的获得破骨细胞的方法。RAW264.7细胞是小鼠源性破骨细胞前体细胞，直接用加RANKL的诱导培养基诱导RAW264.7细胞，即可形成稳定的成熟破骨细胞［4］。

本实验以RAW264.7细胞为研究对象，探究天山雪莲细胞培养物对破骨细胞形成的影响以及对成熟破骨细胞的作用，为国家新资源食品天山雪莲细胞培养物抗骨质疏松的功效学研究和功能食品开发提供实验依据。

1 实验材料

1.1 细胞株 小鼠巨噬细胞RAW264.7，购自中国科学院细胞库。

1.2 实验试剂 DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）（美国Gibco-BRL生命技术有限公司）；噻唑蓝（MTT）（美国Invitrogen有限公司）；核因子κB受体活化因子（RANKL）（美国Sigma公司）；抗酒石酸酸性磷酸酶染液试剂盒（TRAP）（南京凯基生物科技发展有限公司）；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒、细胞凋亡试剂盒（南京建成生物技术有限公司）；对硝基苯基磷酸酯（百灵威）；Trizo1试剂、琼脂糖（美国Invitrogen有限公司）；Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H Free）（2641Q，大连宝生物工程有限公司）；各种引物合成、RT-PCR中使用的酶（华大基因）。

1.3 天山雪莲细胞培养物 样品由大连普瑞康生物技术有限公司提供。雪莲细胞培养物的加工工艺：选取雪莲离体组织，经脱分化形成的愈伤组织作为继代种子，给予一定条件进行继代培养而获得的团块状颗粒，或该颗粒经干燥粉碎得到的粉末。雪莲细胞培养物的提取工艺：在雪莲培养物中加入30％乙醇溶液，雪莲培养物与乙醇的体积比为1∶15，超声提取，温度为85℃，每次提取60 min，连续提取2次，两次所得液体采用60℃减压浓缩获得实验样品。以芦丁作为对照品，分光光度计法检测500 nm光密度（D）值，计算总黄酮的量，以总黄酮的量作为天山雪莲细胞培养物的质量指标。

1.4 实验仪器 垂直层流洁净工作台（上海净化设备有限公司）；二氧化碳培养箱（Hera ce11150，美国Thermo公司）；荧光显微镜（IX71，日本O1ympus公司）；冷冻离心机（Biofuge Stratos，美国Thermo公司）；全波长扫描荧光酶标仪（Varioskan F1ash，美国Thermo公司）；PCR仪（Takara TP-600，日本Takara公司）；全自动凝胶成像系统（英国Syngene公司）。

2 实验方法

2.1 细胞培养和破骨细胞诱导 小鼠巨噬细胞RAW264.7，利用含10％胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，在5％ CO2、37℃细胞培养箱培养，2～3 d传代1次。传代1～2次后待细胞再次完全融合，胰蛋白酶消化后培养，以2×104/孔接种于24孔板，培养12 h贴壁后加入50 ng/mL RANKL诱导破骨细胞生成。诱导6 d后在倒置显微镜下观察，有多核细胞形成［5-6］，进行TRAP染色和Hoechst33342荧光染料染色。

2.2 MTT法测定细胞增殖 取对数生长期、生长状态良好的RAW264.7细胞，以1 000个/孔细胞接种于96孔板中。培养24 h后，分别加入黄酮质量浓度为15.625～500 μg/mL的天山雪莲细胞培养物。药物作用6 d后去除培养基，加入100 μL MTT溶液（0.5 mg/mL）37℃孵育4 h。小心吸取上清液，每孔加入150 μL DMSO溶解紫色结晶甲瓒，混匀。使用酶标仪检测其在570 nm波长下的吸光度值，以630 nm波长下吸光度值为参照。

2.3 乳酸脱氢酶活性测定 乳酸脱氢酶（1actate dehydrogenase，LDH）是机体能量代谢的一种重要酶，检测胞内和胞外LDH的量，是评价细胞膜完整性的一个重要指标。RAW264.7细胞以1 000个/孔接种于96孔板，培养12 h后加入RANKL（50 ng/mL）诱导6 d生成破骨细胞。然后加入不同黄酮质量浓度的天山雪莲细胞培养物（31.25、62.5、125 μg/mL）继续培养48 h。收集细胞培养上清液，根据LDH检测试剂盒说明书进行LDH活性测定。

2.4 破骨细胞TRAP活性测定 以1×104个/mL RAW264.7种于6 cm细胞培养板中，每板4 mL。培养12 h后加入RANKL诱导剂（50 ng/mL）和不同黄酮质量浓度的天山雪莲细胞培养物（31.25、62.5、125 μg/mL）共培养6 d，对照组和诱导组分别加入等体积的DMEM培养基和RANKL诱导剂（50 ng/mL）。处理结束后，收集细胞，用PBS清洗1～2遍后加入细胞裂解液提取细胞内总蛋白。加入100 μL柠檬酸盐缓冲液（50 mmo1/L，pH 4.6，含10 mmo1/L酒石酸钠和5 mmo1/L对硝基苯基磷酸酯），孵育1 h。反应混合液中加入100 μL 0.1 mmo1/L的NaOH终止反应。取200 μL反应液加入到96孔板中，使用酶标仪检测其在410 nm下吸光度值，TRAP活性以相对对照组百分比表示［7］。

2.5 RNA提取及RT-PCR 参照“2.4”项下方法处理细胞，采用Trizo1法提取总RNA，Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）进行RNA反转录。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh）基因表达作为参照，PCR扩增序列为：

①Mouse Trap正向引物为5'-TGACAAGAGGTTCCAGGA-3'，反向引物为5'-AGCCAGGACAGCTGAGTG-3'；

②Mouse Mmp9正向引物为5'-AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-3'，反向引物为5 '-TACATGAGCGCTTCCGGCAC-3'；

③Mouse Gapdh正向引物为5'-AAGCCCATCACCATCTTCCAG-3'，反向引物为5'-AGGGGCCATCCA CAGTCTTCT-3'。

PCR反应条件为：94°C预变性5 min后进入循环；94°C变性30 s，55°C复性30 s，68°C延伸1 min，循环33次；最后72°C延伸7 min。

2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长期的RAW264.7细胞，用含10％ FBS的DMEM培养基调整细胞密度为2×104/孔于6孔板中，在37℃培养24 h，加入RANKL诱导剂（50 ng/mL）和不同黄酮质量浓度的天山雪莲细胞培养物（31.25、62.5、125 μg/mL）共培养6 d，对照组和诱导组分别加入等体积的DMEM培养基和RANKL诱导剂（50 ng/mL）。收集细胞并用PBS液清洗2次。加入磷脂结合蛋白-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）混匀后，室温避光反应10 min，加入碘化丙啶（PI）继续反应3～4 min，上流式细胞仪进行检测。

3 结果

3.1 RAW264.7细胞诱导成为破骨细胞 50 ng/mL RANKL诱导6 d后，RAW264.7被诱导成为圆形、椭圆形或不规则形的多核细胞，该细胞可被TRAP染色，细胞周围可见凸起的伪足，如图1所示。

图1　抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞形态Fig.1 Observation of osteoclastmorphology by TRAP staining

3.2 天山雪莲细胞培养物对破骨细胞形成的影响

3.2.1 RAW264.7细胞增殖（MTT）检测 MTT法检测不同质量浓度天山雪莲细胞培养物对RAW264.7活力影响，如图2所示，当培养物中黄酮质量浓度为15.625～125 μg/mL对RAW264.7细胞没有毒性，并且31.25、62.5和125 μg/mL质量浓度的天山雪莲细胞培养物对RAW264.7细胞具有明显地促进增殖的作用（P＜0.01）。于是选取天山雪莲细胞培养物31.25、62.5和125 μg/mL用于后续实验。

图2　天山雪莲细胞培养物对RAW 264.7细胞增殖的影响Fig.2 Effect of S.involucrata cell culture on the proliferation of RAW 264.7 cells

3.2.2 天山雪莲细胞培养物对破骨细胞形成和TRAP酶活影响 如图3A所示，诱导组加入50 ng RANKL诱导6 d后形成较多的破骨细胞，且形成的胞体较大。加入天山雪莲细胞培养物后破骨细胞形成数少于诱导组。

天山雪莲细胞培养物对破骨细胞TRAP酶活的影响如图3B，相对于诱导组，加入黄酮质量浓度为31.25、62.5、125 μg/mL的天山雪莲细胞培养物均显著降低了TRAP酶活（P＜0.05或P＜0.01），分别为诱导组的（93.36±3.99）％、（71.09±4.73）％、（54.28±2.07）％。

图3　天山雪莲细胞培养物对破骨细胞形成和抗酒石酸酸性磷酸酶活性的影响Fig.3 Effects of S.involucrata cell culture on the form ation and TRAP activity of osteoclasts

3.3 天山雪莲细胞培养物对破骨细胞的影响

3.3.1 乳酸脱氢酶活性检测 如图4所示，与诱导组相比，加入天山雪莲细胞培养物（31.25、62.5、125 μg/mL）处理破骨细胞48 h后，其释放到细胞外的LDH酶活分别为（112.10±2.21）％、（115.06±1.57）％和（116.73±0.33）％（P＜0.01），表明天山雪莲细胞培养物对破骨细胞细胞膜有极显著的破坏作用。

图4　天山雪莲细胞培养物对破骨细胞乳酸脱氢酶活性的影响Fig.4 Effect of S.involucrata cell culture on LDH activity of osteoclasts

3.3.2 天山雪莲细胞培养物对破骨细胞凋亡的影响 如图5所示，诱导组破骨细胞凋亡率为19.6％，而加入黄酮质量浓度为31.25、62.5、125 μg/mL的天山雪莲细胞培养物后，凋亡率分别提高到了26.2％、44.3％和67.9％。

3.3.3 天山雪莲细胞培养物对Trap和Mmp9表达的影响 如图6所示，RANKL诱导形成的破骨细胞可以表达成熟破骨细胞表型标志基因Trap和Mmp9。而在加入天山雪莲细胞培养物后，Trap和Mmp9基因的表达均有下调的趋势。62.5、125 μg/mL的天山雪莲细胞培养物能够显著下调Trap和Mmp9基因表达。

图5　天山雪莲细胞培养物对破骨细胞凋亡率的影响Fig.5 Effect of S.involucrata cell culture on the apoptosis rate of osteoclasts

图6　天山雪莲细胞培养物对破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶和基质金属蛋白酶-9 m RNA表达的影响Fig.6 Effects of S.involucrata cell culture on the expressions of Trap and Mmp9 m RNA in osteoclasts

4 讨论

天山雪莲细胞培养物中主要是黄酮、生物碱和多糖等活性化合物，具有多种药理活性，如缓解疲劳、抗炎镇痛、降低血脂、抗氧化、增强免疫力、抗辐射、增加骨密度等。然而关于天山雪莲细胞培养物对破骨细胞形成的影响还有待研究，本实验初步发现，天山雪莲细胞培养物能够抑制RANKL诱导破骨细胞的形成，并对破骨细胞有破坏作用。

健康的骨骼通过持续的骨重塑来维持，破骨细胞介导的骨吸收及成骨细胞（osteob1asts，OB）介导的骨形成贯穿着人体整个生命周期，而破骨细胞功能的失调会导致各种代谢性骨病。破骨细胞是一类高度分化的多核巨细胞，不能传代，且生命周期短暂［8］，可由骨髓、脾及外周血内的造血干细胞或骨髓远祖细胞经分化、融合而成。破骨细胞的分化主要受骨髓基质细胞和成骨细胞所分泌的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、核因子-κB活化因子受体配体（RANKL）及骨保护素（OPG）等因子的调控。RANKL是促进破骨细胞成熟的必要因素，在RANKL诱导下，RAW264.7细胞能够分化成破骨细胞，并高表达破骨细胞相关基因Trap［9］。TRAP被认为是破骨细胞所特有的功能性标记酶，参与骨基质中钙磷矿化底物的降解，其水平可反映破骨细胞的活性和骨吸收的状态［10］。在RANKL细胞诱导过程中加入天山雪莲细胞培养物可显著抑制多核破骨细胞形成，TRAP活性也可降至诱导组的50％～90％。黄酮质量浓度为62.5和125 μg/mL的天山雪莲细胞培养物作用于成熟的破骨细胞，Trap基因的表达也有显著下调趋势。除此之外，MMP9的量也是破骨细胞溶骨活性的标志，MMP9通过促进破骨细胞移动到骨吸收表面来参与骨吸收过程［11］。黄酮质量浓度为62.5 μg/mL的天山雪莲细胞培养物能够显著降低破骨细胞中Mmp9基因的表达。

LDH是一种胞内酶，天山雪莲细胞培养物处理破骨细胞48 h后，细胞膜损伤，使胞外LDH活性显著增强，呈剂量依赖性。采用Annexin V-PI双染流式细胞术进行细胞凋亡检测，发现天山雪莲细胞培养物能够诱导破骨细胞凋亡，且凋亡率变化呈剂量依赖性；这一结果与LDH活性结果一致。而MTT结果表明，天山雪莲细胞培养物黄酮质量浓度在≤125 μg/mL时对RAW264.7细胞无毒，说明胞外LDH活性的增强和凋亡率的提高是由于天山雪莲细胞培养物对破骨细胞的毒性作用。

综上所述，天山雪莲细胞培养物能够抑制RANKL诱导RAW264.7破骨细胞的形成；并能诱导破骨细胞凋亡，从而降低破骨细胞的骨吸收活性。

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Effects of Saussurea involucrata cell cultures on RANKL-induced osteoclastogenesis

WANG Nan1， TANG Qin1， JIFang-1ing1， DOU Jia2*， BAO Yong-ming1*
（1.School of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian 116O24，China；2.Dalian Institute for Drug Control，Dalian 116O29，China）

ABSTRACT：AIM To investigate the effects of Saussurea involucrata ce11cu1tures on the formation of osteoc1ast as we11 as the activity of mature osteoporosis.METHODS Except in the contro1 group，murine macrophage RAW264.7 ce11s were given the inducingmedium receptor activator of NF-κB 1igand（RANKL）.The effect of S. involucrata ce11 cu1tures（tota1 f1ovenoids from S.involucrata as ca1cu1ated）on osteoc1astogenesiswas observed by tartrate-resistant acid phosphatase（TRAP）and Hoechst 33342 staining and measured by TRAP activity.The viabi1ity of osteoc1astwas detected by LDH assay and f1ow cytometry assay.RT-PCR was emp1oyed to determine the expression 1eve1s of Trap and matrixmeta11oproteinase-9（Mmp9）mRNA in osteoc1ast.RESULTS S.involucrata ce11cu1tures significant1y inhibited RANKL-induced formation ofmu1tinuc1eated osteoc1astand TRAP activity in a dose-dependentmanner.MTT activity assay showed that S.involucrata ce11 cu1tures（≤125 μg/mL）were nontoxic to RAW264.7 ce11s.But it cou1d destroy the ce11 membrane of osteoc1ast，significant1y improving the extrace11u1ar LDH activity and induced apoptosis.S.involucrata ce11 cu1ture marked1y down-regu1ated Trap and Mmp9 mRNA expression at the concentration of62.5 μg/mL.CONCLUSION S.involucrata ce11cu1tures have the potentia1 to inhibit the osteoc1ast differentiation，inducemature osteoc1ast apoptosis and decrease the activity of bone resorption.

KEY WORDS：Saussurea involucrata；ce11 cu1tures；osteoc1ast；TRAP；MMP9；apoptosis

*通信作者：窦 佳（1982—），女，工程师，研究方向为药品分析与检验。Te1：（0411）84255019，E-mai1：djvictory@163.com

作者简介：王 南（1989—），女，硕士，研究方向为药物化学与药理学。Te1：18941411788，E-mai1：d1utwangnan@hotmai1.com

收稿日期：2015-03-23

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.001

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1001-1528（2016）01-0001-06