福林酚比色法测定优泌嘉胶囊中多肽

卫 国， 边海旭， 奚苗苗， 翁 琰， 段佳林， 文爱东

（第四军医大学西京医院药剂科，陕西西安710032）



福林酚比色法测定优泌嘉胶囊中多肽

卫 国， 边海旭， 奚苗苗， 翁 琰， 段佳林， 文爱东*

（第四军医大学西京医院药剂科，陕西西安710032）

摘要：目的 采用福林酚比色（Lowry）法测定优泌嘉胶囊（五谷虫）中多肽含有量。方法 优泌嘉胶囊水提液中加入碱性铜试液和福林酚溶液后，紫外-可见分光光度法在750 nm波长处测定吸光度。结果 优泌嘉胶囊中多肽平均含有量为15.12％，即49.90 mg/粒（以每粒胶囊0.33 g计）。多肽检测质量浓度的线性范围为40.4～404 μg/mL（r= 0.999 0），精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2％，平均回收率为99.6％（RSD为0.96％，n =9）。结论 建立的多肽定量测定方法简单易行，结果准确可靠。

关键词：优泌嘉胶囊；多肽；福林酚比色法

优泌嘉胶囊是由五谷虫（丽蝇科动物大头金蝇Chrysomyia megacephala）虫体经消毒、速冻、打浆、低温真空冻干、过筛、装胶囊等工艺制成的胶囊剂，是第四军医大学附属西京医院的院内制剂，具有滋阴降火、健脾益肾、降脂降糖的功效，临床主要用于糖尿病及其并发症。

五谷虫化学成分复杂，多为高分子有机化合物，主要成分为不同分子质量的蛋白质及肽类［1］。为有效控制该制剂质量，保障药品的安全性和有效性，本实验采用福林酚比色（Lowry）法测定胶囊中多肽含有量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UV2600紫外分光光度计（日本岛津公司）；VP-SOOH超声清洗器（熊猫集团南京电子计量有限公司）；XW-80A涡旋混合器（上海精科实业有限公司）；BSA224S分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）。

1.2 试药 血清白蛋白（牛）对照品（中国食品药品检定研究院，批号140619-201421，纯度100％）。优泌嘉胶囊（自制，批号分别为140729-5、140729-6、140729-7，0.33 g/粒）。福林酚试剂（国药集团化学试剂有限公司，批号20140516，生化纯）；氢氧化钠、碳酸钠、酒石酸钾、硫酸铜都为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品贮备液 取牛血清白蛋白对照品适量，精密称定20.20 mg，置于20 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 对照蛋白溶液 精密量取对照品贮备液2.5 mL至25 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 供试品溶液 取10粒优泌嘉胶囊内容物混匀，精密称取约0.1 g，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加水100 mL，密塞，称定质量，摇匀，超声处理（功率240 W，频率25 kHz）45 min，放冷，再精密称定质量，水补足减失的质量，摇匀，转移至离心管，12 000 r/min离心10 min，取上清，即得。

2.2 测定方法 精密量取供试溶液1 mL至试管内，加碱性铜溶液5 mL，摇匀，37℃放置10 min，快速加入酚试剂0.5 mL，立即摇匀，37℃下放置30 min，显色后，冰浴5 min，按照紫外-可见分光光度法（附录ⅡA），在波长750 nm处测定吸光度。精密量取水1 mL，自“加碱性铜溶液5 mL”起，同法操作，作为空白对照。

2.3 检测波长的确定 取对照蛋白溶液和供试品溶液，分别在400～800 nm范围内进行波长扫描，发现二者的吸收变化一致，均在773.50 nm处有最大吸收。最终确定，以与该波长相近的常用波长750 nm为显色波长。

2.4 线性关系考察 精密量取“2.1.1”项下对照品贮备液（质量浓度为1 010 μg/mL），梯度稀释，制备成质量浓度分别为40.4、80.8、121.2、202、404 μg/mL的蛋白溶液，按“2.2”项下方法操作。以吸光度（A）对质量浓度（C）进行直线回归，得线性方程为A=0.002C+0.076 6（r= 0.999 0），表明蛋白质量浓度在40.4～404 μg/mL范围内，吸光度（A）与质量浓度（C）呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 精密量取“2.1.2”项下对照蛋白溶液1 mL至试管中，自“加碱性铜溶液5 mL”起，按“2.2”项下方法操作，测定吸光度，连续测定6次。结果，RSD=0.080％（n = 6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密称取供试品内容物（批号140729-5）0.1 g，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下方法操作，测定吸光度，每5 min 1次，共7次。结果，RSD为1.0％ （n =7），表明溶液在30 min内稳定性良好。

2.7 重复性试验 精密称取供试品内容物（批号140729-5）0.1 g，共6份，分置100 mL锥形瓶中，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下方法操作，分别测定吸光度，将测定结果代入线性方程，求得6份供试品溶液的多肽含有量。结果，RSD为1.2％（n =6），表明该方法重复性好。

2.8 加样回收率试验 精密称取本品内容物（批号140729-5）约0.01 g，置于100 mL锥形瓶中，共取9份，毎3份为一组，每组分别精密加入“2.1.2”项下对照蛋白溶液10.5、15.0、19.5 mL，再加水补足至25 mL，其余按“2.1.3”项下方法制备加样回收试验混合溶液。

各精密量取上述混合溶液1 mL，分置试管中，自“加碱性铜溶液5 mL”起，按“2.2”项下方法操作，测定溶液吸光度。将测定结果代入线性方程，求得9份供试溶液的多肽含有量，由测得量和加入量计算加样回收率和RSD。结果见表1。

表1　加样回收试验结果（n=9）Tab.1 Results of recovery tests（n=9）

2.9 样品含有量测定 分别精密称取3个批号的优泌嘉胶囊内容物，每个批号2份，各约0.1 g，置于100 mL锥形瓶中，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下方法操作，测定溶液吸光度，将测定结果代入线性方程计算多肽含有量。结果，3批供试品中多肽含有量分别为15.19％、14.91％、15.26％，平均15.12％（RSD= 1.2％），即本品每粒胶囊内容物（0.33 g）中多肽平均含有量为49.90 mg。

3 讨论

福林酚比色法的反应原理为蛋白质或多肽含有的肽键结构在碱性条件下，与铜试剂中的Cu2 +反应，生成蛋白质（多肽）-铜复合物，该复合物中的芳香族氨基酸残基可还原酚试剂中的磷钼酸盐和磷钨酸盐，生成深蓝色的化合物，溶液颜色的深浅在一定范围内与蛋白质或多肽含有量呈正相关。该法是双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质或多肽反应的叠加，灵敏度高。此外，双步反应引起的显色效果增强可减少蛋白质种类差异所致的偏差，具有较强的抗干扰能力［2-4］。故在国家药品标准中普遍采用此法测定水溶性蛋白质和肽类的含有量。

供试品蛋白种类和浓度均影响测定波长的选择。《中国药典》及文献中本法常用的显色波长分别是650、660和750 nm［5-9］。本实验取对照蛋白溶液和供试品溶液，分别在400～800 nm范围内进行波长扫描，发现二者的吸收变化一致，均在773.50 nm处有最大吸收，最终确定以与该波长相近的750 nm为显色波长。

在测定时应注意，酚试剂仅在酸性条件下稳定，但显色反应只在碱性条件时才发生，所以加酚试剂时必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱［10］。同时，碱性铜溶液和福林酚溶液应临用前配制，避免试液发生变质，导致测定结果不准。

本实验中精密度、稳定性、重复性试验的RSD值均小于2％，平均回收率在98％ -102％之间，RSD值小于2％。由此表明，建立的方法简单易行，结果准确可靠，可以用于优泌嘉胶囊中多肽的含有量测定。

参考文献：

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［3］ 路 苹，于同泉，王淑英，等.蛋白质测定方法评价［J］.北京农学院学报，2006，21（2）：65-69.

［4］ 付玉梅，许锦珍，廖 群，等.Lowry法测定寡肽的研究［J］.药物分析杂志，2011，31（4）：739-741.

［5］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版三部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：附录34.

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［9］ 池宁娟，周 虹，高苏莉.福林酚比色法测定转移因子胶囊中多肽的含量［J］.中国药房，2014，25（17）：1617-1618.

［10］ 陈祥娥，边 玲.福林酚试剂法测定蛋白质［J］.食品与药品，2011，13（3）：147-151.

Determ ination of polypeptide in Youm ijia Capsules by Folin-phenol colorimetry

WEIGuo， BIAN Hai-xu， XIMiao-miao， WENG Yan， DUAN Jia-1in， WEN Ai-dong*
（Department of Pharmacy，Xijing Hospital Affiliated to The Fourth Military Medical University，Xi'an 71OO32，China）

ABSTRACT：AIM To app1y Fo1in-pheno1co1orimetry to determining the contentof po1ypeptide in Youmijia Capsu1es（Chrysomyia megacephala）.METHODS A1ka1ine copper and fo1in-pheno1so1utionswere added into samp1es to revea1absorbance at the detection wave1ength of750 nm by u1travio1et spectrophotometer.RESULTS The 15.12％average content of po1ypeptide in Youmijia Capsu1es，meaning a 49.90 mg po1ypeptide content ca1cu1atedbook=92,ebook=98（a capsu1e weight of0.33 g）.The 1inear range of po1ypeptide waswithin 40.4 -404 μg/mL（r=0.999 0）.The RSDs of precision，stabi1ity and reproducibi1ity tests were a11 1ower than 2％.The average recovery was 99.6％ with the RSD of 0.96％（n =9）.CONCLUSION The estab1ished method is simp1e and re1iab1e for the assessment of po1ypeptide in Youmijia Capsu1es.

KEY WORDS：Youmijia Capsu1es；po1ypeptide；Fo1in-pheno1co1orimetry

*通信作者：文爱东（1964—），男，主任药师，博士生导师，主要从事合理用药与新药研发。Te1：（029）84773636，E-mai1：adwen-2012@hotmai1.com

作者简介：卫 国（1987—），男，硕士，药师，主要从事新药研究与开发。Te1：（029）84775475-8210，E-mai1：qigaidaren@163.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81470174）；第四军医大学西京医院学科建设助推计划重大新药研发项目（XJZT14D06）

收稿日期：2015-05-22

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.019

中图分类号：R927.2

文献标志码：A

文章编号：1001-1528（2016）01-0091-03