滋肾活血方对冠心病心肌缺血肾虚血瘀型大鼠外周血浆中ET、NO及IL-18含量的影响*

刘如秀，周晟芳，李 慧，关宣可，尹琳琳，罗何维，刘金凤

(中国中医科学院广安门医院，北京 100053)

滋肾活血方对冠心病心肌缺血肾虚血瘀型大鼠外周血浆中ET、NO及IL-18含量的影响*

刘如秀，周晟芳，李 慧，关宣可，尹琳琳，罗何维，刘金凤

(中国中医科学院广安门医院，北京 100053)

目的:观察滋肾活血方对冠心病心肌缺血肾虚血瘀型大鼠外周血浆中内皮素(ET)、一氧化氮(NO)及白介素(IL)-18含量的影响，以探索该药的作用机制。方法:将60只大鼠按随机数字表法分成空白对照组、模型组、小剂量组、中剂量组、大剂量组5组各12只。采用“结扎左冠状动脉前降支+注射氢化可的松法”造模。造模后给药各组分别给予不同剂量滋肾活血方药液，连续灌胃7 d记录心电图，腹主动脉取血检测ET、NO及IL-18含量。结果:滋肾活血方可以预防肾虚血瘀模型大鼠缺血心肌坏死性Q波产生，减轻心肌损伤，并能降低血浆中ET及IL-18含量，升高NO水平。结论:滋肾活血方对冠心病心肌缺血肾虚血瘀型大鼠心电图所示的心肌缺血有改善作用，其可通过抗炎、稳定动脉斑块、减轻心肌缺血程度，从而达到改善肾虚血瘀证冠心病心肌缺血的作用。

滋肾活血方;心肌缺血;内皮素;一氧化氮;白介素-18

冠状动脉缺血性心脏病是冠状动脉粥样硬化引起心肌供血不足所致的心脏病，是心血管系统的常见多发病，临床以胸痛等一系列心肌缺血表现为主，目前已成为影响人类健康的重大疾病，发病率呈逐年上升趋势［1-2］。临床和基础研究表明，冠状动脉缺血性心脏病患者以肾虚血瘀证多见。前期临床研究证实，国医大师刘志明创立的滋肾活血方治疗本病疗效确切［3-4］。本研究通过制备心肌缺血肾虚血瘀模型大鼠，观察滋肾活血方对其心电图的影响，并通过检测血浆中代表性斑块形成因子内皮素(Endothelin，ET)、一氧化氮(Nitric oxide，NO)及炎症因子白介素18(Interleukin 18，IL-18)含量的改变，探索滋肾活血方治疗冠心病心肌缺血肾虚血瘀证的作用机制。

1 材料

1.1 动物

SPF级 Wistar大鼠60只，雌雄各半，体质量(250±20)g，由北京维通利华实验动物科技有限公司提供(许可证号SCXK(京)2012-0001)。饲养于中国中医科学院广安门医院SPFII级动物房，饮用纯净水，饲以合格大鼠饲料，相对湿度45%～70%，环境温度18℃～22℃。

1.2 主要试剂与药物

滋肾活血方药液由广安门医院大兴制剂中心制备，制备时投入生药3kg(首乌、栝楼、三七等)，出药液3 L，含生药量1 g/ml。戊巴比妥钠由上海艾研生物有限公司提供，盐酸利多卡因注射液由北京益民药业有限公司提供;注射用青霉素钠由华北制药股份有限公司提供，大鼠ET、IL-18、NO试剂盒由上海沪宇生物科技有限公司提供。

2 方法

2.1 造模方法

用“左冠状动脉前降支结扎方法联合注射氢化可的松法”制备冠心病心肌缺血肾虚血瘀病证结合模型［5-6］。具体步骤如下:①开放气道:按0.4 ml/ 100 g腹腔注射浓度1%的戊巴比妥钠麻醉大鼠，行气管插管，连接呼吸机(设置参数:呼吸比1∶2，潮气量3 ml/kg，呼吸频率80次/min);②结扎手术:逐层开胸暴露心脏，结扎冠状动脉前降支(从左心耳下边缘入针，肺动圆锥处下1 mm出针);③观察缝合:观察心电图，如II和V2导联显示出以下任一图形特点即为造模成功:ST段弓背向上，J点抬高1.5 mv;T波低平(50%)、双向、倒置;ST段下移0.5 mv。成功制备左前降支梗死缺血模型后缝合，苏醒后拔气管插管;给予20万U青霉素抗感染治疗3 d。皮下注射氢化可的松注射液3.7 mg/kg，每日1次，连续7 d。

2.2 动物分组与给药方法

60只Wistar大鼠按随机数字表法分为空白对照组、模型组、大剂量组、中剂量组和小剂量组5组各12只。造模后，模型组、小剂量组、空白对照组各死亡3只，大剂量组死亡4只，中剂量组死亡5只。

青霉素治疗3 d后，于第4天开始灌胃给药。大剂量组每日以生药量21.6 g/kg灌服滋肾活血方药液;中剂量组每日以生药量10.8 g/kg灌胃;小剂量组每日以生药量5.4 g/kg灌胃。空白对照组和模型组给予等量纯净水，连续灌胃7 d。

2.3 取材与指标检测方法

灌胃后第7天连接多导联心电图记录仪描记心电图，随后腹主动脉取血，置于抗凝管，4℃，3000 r/ min离心20 min，取上清(血浆)－20℃保存。采用双抗夹心酶联免疫吸附方法，参照试剂盒说明书检测各组大鼠血浆中ET、NO及IL-18含量。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 冠脉结扎手术对模型大鼠心电图的影响

图1显示，术前大鼠心电图未见心律失常，II、V2导联QRS波群呈Rs波形，无异常Q波，ST段无抬高或压低等。术后大鼠心电图出现明显缺血改变，II、V2导联QRS波群与抬高的ST段融合，II导联表现为“M”形，V2导联为红旗形，提示冠脉结扎手术成功，心肌缺血模型制备完成。

图1 冠脉结扎手术对模型大鼠心电图的影响

3.2 滋肾活血方对冠心病心肌缺血肾虚血瘀模型大鼠心电图的影响

取材前采集心电图，比较空白对照组，模型组出现明显心肌缺血坏死，II、V2导联均出现坏死性Q波，II导联QRS波群呈QS波形，V2导联呈QS波形，ST段压低明显。与模型组比较，大剂量组与正常组接近，未见异常Q波，II导联正常，QRS波群呈Rs波形，ST段无抬高或压低，V2导联QRS波群呈RS形，T波略低平;中剂量组无坏死性Q波，但仍有缺血表现，II导联 QRS波群呈Rs波形，V2导联QRS波群呈R波形，ST段与R波融合呈红旗形，T波低平;小剂量组心肌坏死缺血表现减少，II导联QRS波群呈Rs波形，V2导联存在坏死形Q波，QRS波群呈QS波形，ST段均存在明显压低。图2显示，随着药物剂量加大，心肌缺血损伤逐渐减轻，心肌坏死发生率明显降低。

图2 滋肾活血方对各组大鼠心电图的影响

3.3 滋肾活血方对冠心病心肌缺血肾虚血瘀型大鼠外周血浆ET、NO、IL-18含量的影响

与空白对照组比较，模型组ET含量显著升高(P＜0.01)。给予大、中、小剂量滋肾活血方灌胃后，均可以不同程度降低血浆ET浓度，大剂量、中剂量与模型组比较，ET含量均显著性下降(P＜0.01)。3组之间比较，随着给药浓度增加血浆ET浓度有所降低，组间比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

与空白对照组比较，模型组血浆NO浓度显著降低(P＜0.01)。比较模型组，给予不同剂量滋肾活血方灌胃后，均不同程度升高血浆NO浓度(P＜0.01，P＜0.05)。大剂量组与空白对照组比较差异无统计学意义。大剂量组与中、小剂量组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1显示，模型组血浆IL-18含量与空白对照组比较显著增加(P＜0.01)。灌胃大、中、小剂量滋肾活血方后均可不同程度降低血浆IL-18含量，大剂量与模型组比较IL-18含量显著减少(P＜0.01)，与空白对照组比较差异无统计学意义。中、小剂量相对于模型组IL-18含量明显下降(P＜0.05)。3组之间比较，随着给药浓度增加，血浆IL-18浓度降低，中、小剂量组相对大剂量组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，中、小剂量组之间比较差异无统计学意义。

表1 5组大鼠外周血浆ET、NO、IL-18含量变化(±s，℃)

注:与空白对照组比较:△△P＜0.01;与模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与大剂量组比较:#P＜0.05，##P＜0.01;与中剂量组比较:▲▲P＜0.01

组 别 鼠数 血浆内皮素浓度 血浆白介素18浓度 血浆一氧化氮浓度空白对照组9 30．16±0．51 63．88±3．25 57．09±3．57模 型 组 9 54．92±2．88△△ 85．23±12．27△△ 41．76±10．46△△大剂量组 8 44．75±2．33＊＊△△## 65．26±4．98＊＊## 56．90±2．92＊＊#中剂量组 7 48．50±2．15＊＊△△▲▲ 71．55±2．30＊△△ 52．45±2．60＊△△小剂量组 9 52．82±3．25△△ 73．18±5．65＊△△ 51．56±8．49＊△△

4 讨论

冠心病主要表现为胸痛及由心肌缺血缺氧引起的其他症状，中医证型以肾虚血瘀证居多。心电图是诊断和判断疗效的常用检查方法［7］，冠状动脉痉挛或闭塞时，冠脉血流量骤减，在心电图上表现为ST段和T波改变。经研究证实，II导联能较好地呈现冠状动脉前降支心肌缺血状态，故本实验选用II、V2导联记录心电图。结扎冠状动脉前降支手术过程中可见II、V2导联的QRS波群与抬高的ST段相融合，呈明显的心肌缺血表现，证明心肌缺血模型制备成功。滋肾活血方不同剂量组与模型组比较均有不同程度改善，且药物剂量与心肌缺血改善为正相关关系。随着剂量加大，坏死性Q波消失，ST段升高与T波压低程度明显减少，其中高剂量组与空白对照组较接近，说明运用滋肾活血方能缓解冠脉痉挛、扩张冠脉、降低心肌氧耗从而改善心肌功能，达到抗心肌缺血、防止心肌损伤的作用。

ET是由内皮细胞合成的环形多肽类血管活性物质，是内源性收缩因子中最强的长效血管收缩剂之一，有强大的促血管平滑肌细胞增殖、收缩心肌和血管作用，能诱发动脉硬化及斑块形成，对维持心血管系统稳态有重要作用［8］。IL-18由巨噬细胞、T淋巴细胞等多种细胞产生，可促使心肌细胞释放黏附因子和炎症递质，通过诱导干扰素γ产生激活巨噬细胞、淋巴细胞、单核细胞和内皮细胞发生炎性反应［9-10］，是冠心病发生发展的危险因素，其高度表达与斑块不稳定性呈正相关关系，是独立预测致死性心血管事件的因子［11-12］。NO是一种由内皮细胞合成并释放的舒血管因子，能够保持冠脉动态平衡，维持正常心肌的供血，对缺血后心肌有较好保护作用，是调节心血管系统的重要血管活性物质［13］。实验结果表明，滋肾活血方能降低冠心病心肌缺血肾虚血瘀模型大鼠血浆中ET、IL-18含量，且随着给药浓度的增高，下降趋势更加明显;此方对促进NO的合成有积极作用，说明滋肾活血方通过抑制血管过度收缩及炎性反应、舒张血管，达到保护心血管，防止心肌缺血的作用。

滋肾活血方是国医大师刘志明治疗冠心病的原创方，亦是广安门医院院内协定处方，前期大量研究已证明了该方的安全性及有效性［4，14］。刘志明认为冠心病多为虚实夹杂，患者多有体质本虚和久病伤正的特点，独用祛瘀化浊通痹难获良效，须兼以扶正。全方配伍通补兼施，扶正祛邪并用，方由栝楼、薤白、三七、桑椹、制首乌等组成。肾为五脏之根、先天之本，如禀赋素弱或无规律作息日久均累及肾。心火居上，肾水居下，心肾交通，水升火降，则水火相济，病无以生;若阴阳失衡、水火不济则疾病丛生。刘老认为扶正首当滋肾固肾，多数冠心病心肌缺血患者存在心肾同病状态，心肾同治可获良效。本研究证实，通过比较各组心电图发现滋肾活血方能有效阻止心肌损伤坏死，减轻心肌缺血症状;通过观察ET、IL-18、NO指标发现，滋肾活血方能抑制血管活性因子释放，降低炎症反应发生，从而扩张冠脉减少心肌缺血发生，为阐明滋肾活血方的作用机理提供依据。

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Effect of Ischemic Myocardium in Coronary Heart Disease Rats with Kidney Deficiency and Blood Stasis on IL-18，NO and ET by Using ZiShen HuoXue Recipe

LIU Ru-xiu，ZHOU Sheng-fang，LI Hui，GUAN Xuan-ke，YIN Lin-lin，LUO He-wei，LIU Jin-feng
(Guanganmen hospital，China academy of Chinese medicine science，Beijing 100053，China)

Objective To observe the changes of ET，NO and IL-18 in plasma of myocardial ischemia rats with kidney deficiency and blood stasis syndrome，explore the mechanism of this disease which is cured by ZiShen HuoXue recipe．Method Selected 60 healthy Wistar rats，the rats were randomly divided into control group、model group、small-dose group、middle-dose group and large-dose group．There are 12 rats in each group．Building the myocardial ischemia model rats with kidney deficiency and blood stasis by ligating the left anterior descending coronary artery and injecting the hydrocortisone．Small，medium and large dose groups were given 5.4g/kg/d，10.8g/kg/d，21.6g/kg/d ZiShen HuoXue recipe，blank control group and model group were treated with pure water．Respectively corresponding drug intervention 7 days，then get ECG before draw blood from abdominal aortic，check the levels of ET，NO and IL-18 by Elisa．Result ZiShen HuoXue recipe can prevent the Q wave from ischemia in rats with kidney deficiency and blood stasis model，reduce myocardial injury，and decrease the level of IL-18 and ET in plasma，and increase the level of NO．Conclusion:The appropriate amount of ZiShen HuoXue recipe could improve the ECG of myocardial ischemia model rats，and reduce the myocardial ischemia by anti inflammation and stable arterial plaque，and improve the effect of myocardial ischemia and blood stasis syndrome．

ZiShen HuoXue recipe;myocardial ischemia;ET;NO;IL-18

R285.5

B

1006-3250(2016)01-0054-03

2015-05-11

北京市自然科学基金资助项目(7122153)-名老中医滋肾活血方对鼠缺血心肌蛋白组学及分子机理研究;北京中医药薪火传承“3+3”工程项目(830104)-刘志明名老中医工作室;中国中医科学院“名医名家传承”项目(CM20141006)-刘志明学术思想与临床经验传承研究

刘如秀(1954-)，女，湖南人，主任医师，从事中西医结合心血管疾病的临床与研究。