microRNA在睾丸肿瘤中的最新进展

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microRNA在睾丸肿瘤中的最新进展

谭于龙综述钱辉军审校

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关键词：微小RNA；睾丸肿瘤；生物标志物

在世界范围，睾丸肿瘤是泌尿生殖系统少见的肿瘤之一，只占泌尿生殖系统肿瘤的5%左右。然而，20~35岁的年轻男性睾丸肿瘤的发病率高于其他肿瘤。在我国，睾丸肿瘤占泌尿生殖系统的3%~9%[1]。2004年国际卫生组织(WHO)将睾丸肿瘤的病理亚型分为：生殖细胞肿瘤(包括精原细胞瘤、卵黄囊瘤、畸胎瘤等)；性索/性腺间质肿瘤(包括间质细胞瘤、支持细胞瘤等)；其他非特异性间质肿瘤。超过95%的睾丸癌为睾丸生殖细胞肿瘤(testicular germ cell tumor/TGCT)。睾丸癌多为单侧发病，双侧发病者仅占1%左右。目前对睾丸肿瘤的发病机制还不十分清楚，危险因素包括隐睾或睾丸下降不全、家族遗传因素、Klinefelter综合征等。近年来，遗传学研究的不断进步，改善了临床上对睾丸肿瘤的诊断和治疗。表观遗传学研究作为遗传学研究的新分支，有望为睾丸肿瘤的诊断及分型、制定治疗方案和监测治疗效果、预测预后带来一场革命。

1microRNA的合成、运输及作用机制

随着对人类基因组认识的不断加深，我们现在认识到，只有不到2%的基因是由编码区(外显子)组成的，而这些编码区就是合成mRNA的模版[2]。过去认为余下的基因没有生物功能，然而，近20年来，这些非编码区的功能被不断发掘出来，对应的RNA命名为非编码RNA(non-coding RNA)[3]，其中一类称为微小RNA(microRNA/miRNA)。原始miRNA(primary miRNA/pri-miRNA)是茎环样结构，由RNA聚合酶Ⅱ转录得到，有多种miRNA基因定位于编码基因的内含子，其中的CpG岛是miRNA转录的启动子，此外，DNA甲基化可以导致RNA聚合酶Ⅱ基因沉默。原始miRNA在细胞核内通过微处理器剪切为独立的发夹样结构，称之为前体miRNA，然后通过exportin-5(输出蛋白5)的协助运输到细胞质，经Dicer剪切为长度19～22个核苷酸的成熟miRNA[4]。在细胞质内，miRNA完全或部分互补结合到靶mRNA，可以形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)，控制mRNA的降解或转录后翻译抑制，最终调节靶基因的表达[5]。每种miRNA可以调控多种mRNA，并且每种mRNA也都受到多种miRNA的调控。据估计，人类有30%～70%的基因受miRNA调控[6]。研究表明，miRNA不仅参与正常的生理过程，如细胞分化、发育时序的控制、细胞凋亡、细胞增殖等等，还涉及一些病理过程，例如肿瘤的发生[7]。

Voorhoeve等发现，在野生型p53存在的情况下，表达miR-372和miR-373的细胞，可以对抗DNA损伤而防止衰老。对这个机制进一步的探讨，发现miR-372和miR-373可以结合到p53的下游区域，并模仿无活性p53的功能[8]。鉴于肿瘤抑制因子2(large tumor suppressor 2，LATS2)删失可以加速细胞增殖并最终导致肿瘤形成，研究者确定了LATS2是p53信号通路的潜在靶点。在一些LATS2突变的精原细胞瘤中，并不过表达miR-372和miR-373。LATS2蛋白抑制细胞周期蛋白E/CDK2的活性，从而中止细胞周期。最新的研究发现，几乎所有的精原细胞瘤和大多数胚胎癌都特定的过表达miR-372和miR-373[9]。

在精子发生的过程中，基因表达的时间性和空间性至关重要。精原细胞有周期性的转录沉默期，因而使得转录后调节显得很重要[10]。无论是精原细胞瘤还是非精原细胞瘤，都是由早期的病灶发展而来，研究发现原位癌(carcinoma in situ，CIS)源于精原细胞形成精子的功能障碍[11]。在精子的生发过程中，miRNA表达谱的改变与原位癌的发生密切相关，生发期间上调的miRNA有miR-136、miR-743a、miR-463，下调的miRNA有miR290-5p、miR291a-5p、miR-294、miR-293，对以上miRNA的靶点进行分析，提示这些miRNA可能作用于PTEN、CXCR4以及Wnt/β-catenin信号通路，参与睾丸生殖细胞肿瘤的转移[12]。PTEN是一种肿瘤抑制因子，可以阻断PI3K信号通路，从而对细胞生长起到负性调节作用。因此PTEN的抑制促进细胞增殖加速，最终导致肿瘤发生。原位癌的侵袭性转化也涉及PTEN的缺失[13]。此外，作为PIK激酶的负性调节因子，PIK3IP1的缺失与睾丸生殖细胞肿瘤的复发率上升有关[14]。miR-199a的功能取决于其下游靶点。在睾丸生殖细胞肿瘤中，MAFB可能是miR-199a-5p的靶点，并且miR-199a-5p的肿瘤抑制效应是由MAFB调控[15]。

2microRNA的诊断意义

通过多重分析和检测手段，发现miR-371-3和miR-367对于睾丸癌的诊断有重要意义。在诊断的过程中，可以从患者的血清中分离这些miRNA，并与正常对照做对比。在一项包含病理确诊患者和正常对照的研究中，传统的AFP和hCG检查的诊断准确率不超过60%，并且对精原细胞瘤的诊断准确率仅有40%，但在结合TsmiR检测之后，诊断准确率提高到98%[16]。在精原细胞瘤的诊断中，TsmiR检测相对现有的AFP/hCG检查的优势巨大。这个结果在探讨其他起源的睾丸癌的研究中得到了进一步确认[17]。然而，对于患者血清中的miRNA水平是否可以预测存在转移灶，还需要做进一步的研究。此外，miR-371-3和miR-367可用于高危人群的筛查，例如性发育障碍(disorders of sex development，DSD)的患者。另外一项报告显示，如果血清中可以检测到过表达的miR-371-373和miR-302，提示患有睾丸生殖细胞肿瘤[18]。Murray等分析8例睾丸生殖细胞瘤后发现，其血清miR-372和miR-367水平在诊断时普遍发生升高，并且血清miR-372和miR-367水平还与肿瘤总体积有关[17]。

最近有一项令人兴奋的发现，那就是根据不同的miRNA表达谱，可以区别不同的睾丸癌亚型，例如miR-122a只在卵黄囊瘤中表达。miR-371-373和miR-302a-d簇在精原细胞瘤中上调，但仍低于正常睾丸组织中的水平，可以被用来鉴别畸胎瘤、胚胎细胞癌以及卵巢内胚层窦瘤[19]。

3治疗、预测治疗反应性与监测

临床上对睾丸生殖细胞肿瘤的治疗与监测，是基于血清生物标志物的检测之上。然而，仅有不到60%的患者的AFP(a-fetoprotein/甲胎蛋白)、hCG(human chorionic gonadotropin/人绒毛膜促性腺激素)和LDH(lactatec dehydrogenase/乳酸脱氢酶)升高[20]。miRNA在体液内高度稳定，并且有些miRNA在肿瘤组织内大量表达。在一项包括24例睾丸癌患者(20例为Ⅰ期，另外4例为Ⅱ或Ⅲ期)的临床试验中，抽取患者在治疗前和治疗后的血液标本进行分析，显示所有患者的血清miR-371a-3p、miR-372、miR-373-3p水平明显高于健康对照(17例)。在Ⅰ期睾丸癌患者中，3种血清miRNA水平在术后显著降低，低于正常水平。而在Ⅱ或Ⅲ期患者，血清miRNA水平在治疗结束后回归到正常水平[21]。另一项研究，11例患者均为Ⅰ期睾丸癌(6例精原细胞瘤，5例非精原细胞瘤，平均年龄35岁)，对照组为12名健康男性(平均年龄36岁)，检测患者在睾丸切除术之前和术后5天的血清miRNA水平，术前和术后的miRNA水平比较采用双侧Mann-Whitney U检验，结果显示睾丸癌组术前miR-371-3水平显著高于对照组，睾丸癌组术后的miR-371、miR-372、miR-373水平分别为术前的1/304、1/24、1/13(P<0.01)[22]。

顺铂是治疗睾丸生殖细胞肿瘤的常用化疗药物，然而在化疗结束后，顺铂的毒性还会持续很长一段时间，无疑降低了患者的生活质量。癌细胞的miRNA可以影响其对化疗的反应性，调节细胞对化疗药物的敏感性。在一项研究中，研究者评估NT2细胞(睾丸生殖细胞肿瘤细胞株NTERA-2)[23]的miR-302a对顺铂细胞毒性的影响。在顺铂处理的NT2细胞，miR-302a出现了升高。miR-302a的下调可以增加NT2细胞对顺铂的敏感性，因为miR-302a的下调促进顺铂诱导的G2/M期阻滞，从而加速细胞凋亡。miR-302a还通过降低凋亡临界值而提高顺铂的杀伤效果。并且，这种效应在另外一种睾丸生殖细胞肿瘤细胞株NCCIT中也可以见到。此外，miR-302a还可以下调NT2细胞中p21的表达，从而提高细胞对顺铂的敏感性。miR-302a介导的细胞凋亡，还可以通过p53沉默而得到进一步加强。因此，miR-302a可以为睾丸生殖细胞肿瘤的治疗干预提供一个新选择[24]。另一个研究通过上调miR-383、抑制蛋白磷酸酶1和调节亚基10(PNUTS)的表达，显著增强顺铂对NT2细胞造成的DNA损伤，这可能是因为miR-383影响H2AX基因的磷酸化[25]。通过转染miR-372和miR-373到人类原生细胞，可以抑制致癌基因Rasv12调控的细胞增殖，可用来开辟新的治疗方法。

4预后及随访

评判生育能力的常用方法是精子质量分析和检测血清激素水平，但这些手段的评价尺度不一，并且对睾丸的某些微小但意义重大的变化不敏感[26]。在动物模型中敏感性很高的组织病理学检查方法，目前受限于各方面的条件而不能用于临床[27]。因此，亟需发掘对睾丸损伤敏感的生物标志物，以监测生育功能，尤其是在进行生殖腺毒性化疗之后。成熟的精子含有miRNA，异常的miRNA与少精症和无精症有关，提示miRNA对于精子发挥正常功能很重要[28]。有学者认为，精子递送到卵子的miRNA在正常的胚胎发育中能发挥作用[29]。

对睾丸癌患者其睾丸切除术之前和之后的miRNA水平进行分析，提示miRNA可能具有预测预后价值。相比正常对照，所有睾丸切除术之后的血清标本中的miRNA水平没有差异。目前，有研究正在探索TsmiR在随访中的作用。无论是在成人或是儿童睾丸癌患者，TsmiR都有望成为随访的重要工具[30]。

综上所述，近年来随着对miRNA研究的不断深入，miRNA在睾丸肿瘤的诊断、治疗及检测中，可以同时具有高特异性和高敏感性，并易于检测。虽然目前的研究表明miRNA有美好的前景，但无疑还需要经过大量的研究才能证实。

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(编辑：甘艳)

(收稿日期2015-04-20修回日期 2015-08-24)

文章编号：1001-5930(2016)04-0694-03

中图分类号：R737.21

文献标识码：B

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.04.056

通讯作者：钱辉军