大鼠小肠移植动物模型的进展

杨洋，沈中阳，宋红丽（.天津医科大学一中心临床学院，天津 3009；.天津市第一中心医院器官移植中心，天津 3009）

目前，小肠移植是公认的唯一能够治疗小肠功能衰竭的方法[1]。自从1964年Detterling完成首例临床小肠移植以来，小肠移植得到越来越广泛的开展。根据小肠移植登记处最新公布的资料显示，截止到2013年2月2日为止，全球82个移植中心共对2 699例患者完成了2 887例小肠移植。目前，全球小肠移植患者的总体1年、5年及10年累积存活率已分别达到76%、56%和43%[2]。然而，由于小肠富含淋巴组织，肠腔内存在大量微生物，导致移植后容易发生排斥反应和不易控制的感染。因此，小肠移植无论在疗效还是手术数量上均远远落后于其他实质性脏器移植。排斥、感染、缺血/再灌注损伤及移植肠失功已成为小肠移植的主要问题[3]。而小肠移植的实验研究是解决这些问题必不可少的环节。因此，建立可靠且重复性好的小肠移植模型尤为必要，大鼠小肠移植便是其中应用和研究最广泛的动物模型。随着器官移植理论研究的深入和血管吻合技术的进步，大鼠小肠移植模型也在不断改进，其成功率和存活率有了很大提高。

根据移植肠解剖位置不同，大鼠小肠移植模型大致分为两种，即异位小肠移植与原位小肠移植[4]。大鼠异位小肠移植由Monchik和Russel于1971年首次完成[5]。此术式中受体小肠被完整保留，仅对供体小肠行血管吻合，供肠两端于腹壁造瘘。此模型相对简单，造模成功率也相对较高，主要用于排斥反应、移植物抗宿主病等移植免疫的研究[6-8]。大鼠原位小肠移植由Kort于1973年首次建立[9]。此术式在完成供肠血管吻合之后，将受体全部小肠移除，其两端分别与供肠两端做端端吻合。此模型更符合生理特征，但建模更为复杂，主要用于正常生理状态下移植小肠功能及其与免疫反应相互作用的研究[10-11]。建立该模型的主要技术难点基本一致，主要围绕以下几点进行改进。

1 供体小肠保存方法

Belzer等[12]于1988年提出移植器官保存液须满足以下几个方面的要求：降低由于低温保存所导致的细胞水肿；防止细胞的酸化作用；防止器官灌洗保存过程中细胞间隙的膨胀；防止氧自由基的损伤，尤其是再灌注过程中的损伤；能够提供可再生高能磷酸化合物的底物。乳酸林格液因其价格便宜且能够满足实验器官保存的基本要求而被广泛用于大鼠移植小肠的灌注及保存[13]。与其他器官相比，小肠黏膜对缺血和缺氧极为敏感，保存也更为困难。有研究人员将移植小肠保存于乳酸林格液并置于高压氧环境中，结果发现移植小肠黏膜的受损程度及组织损伤面积均小于正常氧分压下保存的小肠[14-15]。赵利辉等[16]对比了HTK液与UW液保存大鼠移植小肠的效果，结果发现两组所有生化指标均优于对照组，且当保存时间在8 h以内时HTK液保存小肠效果优于UW液，但长时间保存的结果显示UW液组保存小肠的效果优于HTK液组。Huang等[17]将高渗枸橼酸盐腺嘌呤溶液中加入猪聚合血红蛋白来保存大鼠移植小肠，结果发现其保存效果优于UW液及未加入猪聚合血红蛋白的高渗枸橼酸盐腺嘌呤溶液。另有研究将大鼠供肠保存于UW液并置于含有CO或O2的环境中，结果发现与单纯UW液保存的小肠相比，其移植术后小肠黏膜变性水肿及组织损伤明显减轻[18-19]。此外，在Euro-Collins保存液中加入谷氨酰胺能明显减轻低温保存小肠的再灌注损伤，抑制低温保存损伤导致的肠黏膜通透性增加，减少细菌易位和毒素的吸收，保护低温保存的小肠组织结构和屏障功能[20]。

2 受体血管重建技术的改进

血管重建是小肠移植的关键技术，血管吻合不良导致的出血、狭窄以及吻合时间过长加重缺血/再灌注损伤和血流动力学紊乱是造成手术失败的主要原因。具备熟练和完善的显微外科技术、简化手术操作、降低操作客观难度是提高建模成功率的必要条件[21-22]。

经典的小肠移植是供体带肠系膜上动脉的腹主动脉袖和门静脉分别与受体腹主动脉、下腔静脉端侧吻合来完成血管重建[23]。血管的吻合方法可分为单纯间断缝合法、单纯连续缝合法、间断褥式缝合法和连续褥式缝合法等。一般认为，单纯间断缝合是最安全的缝合方法，其吻合口对合准确，而且术后血流通畅率高；单纯连续缝合法较单纯间断缝合法缝合速度快，缝合完成后，吻合口漏血现象极少发生，但缝线被拉紧后，造成吻合口狭窄，且容易出现吻合口血管内膜对合不良；间断褥式缝合法可以保证血管吻合口外翻，内膜与内膜相对合，但是显微操作困难，因此较少使用；连续褥式缝合法是最易导致血管吻合口狭窄的方法，因此极少使用[24]。无论使用哪种吻合方法，均要求操作者具有较丰富的显微外科经验以及较高的血管吻合水平。在此基础上，对一些细节的改进可进一步提高手术的成功率。肇毅等[25]在静脉吻合时采用下腔静脉前壁“一”字形切口取代传统的椭圆形切口，切口长度较门静脉周径略长，使吻合口形成一定张力以避免出血，此法结合间断缝合的方式可绝对避免吻合口及下腔静脉狭窄的发生。在王一芳等[26]报道的小肠移植模型建立的研究中，将供体门静脉于左右肝静脉分叉处剪断，保证静脉断端开口宽大，与受体下腔静脉吻合后不易发生吻合口狭窄或闭塞，同时将移植物腹主动脉段与受体剪断的腹主动脉作两个端端吻合而不是端侧吻合，避免了袖口难以修剪平整、吻合口对接不良的缺点，同时也保证了供肠足够的动脉灌注压。王永向等[27]将带有肠系膜上动脉的腹主动脉修剪为漏斗状袖片，采用此漏斗状袖片与受体腹主动脉行端侧吻合可使吻合口足够大，从而降低操作难度，同时可使血管内膜对合更加良好。韩璐荣等[28]在修剪供肠腹主动脉补片以及在受体腹主动脉前壁开口时，均使用弯头弹簧剪，以获得规则的血管开口，避免了反复修剪及开口不规则的问题，使吻合口对接良好，减少了吻合口并发症的发生。研究人员在建立大量大鼠小肠移植模型的基础上发现，对于具有一定显微外科操作基础的术者来说，在动脉吻合时可采用一点固定连续缝合法，此法管腔暴露清楚，不易缝及对侧侧壁，操作方便，明显缩短了吻合时间，提高了大鼠小肠移植建模的成功率[29]。

由于显微外科操作复杂，单纯的血管吻合实现血管重建需要长时间的练习，对于初学者来说极难掌握，同时由于手术需阻断腹主动脉和下腔静脉，对血流动力学影响较为严重，造成手术成功率低，并发症多[30]。随着现代血管重建技术的改进，大鼠小肠移植操作逐步简化，手术成功率大有提高，套管法为其中较为成功的一种方法，其操作简单易行，血管重建时间大大缩短，而且不会发生吻合口狭窄。根据采用的套管数量可分为单套管、双套管及三套管法等。

单套管法是将供肠动脉与受体腹主动脉行端侧吻合后，切除受体左肾，将带有cuff套管的供肠门静脉套入受体切断的左肾静脉，从而实现静脉重建。此法操作简便、迅速，同时保证血管内膜对合良好，这在一定程度上避免了吻合口狭窄、出血、血栓形成等血管吻合常见并发症，降低了操作难度且简化操作后大大缩短了手术时间，使手术成功率和模型成活率明显提高[27，31]。

双套管法对于大鼠小肠移植模型来说可行性小，目前尚无相关报道。

三套管法是将供肠所带的腹主动脉桥两端分别置入套管，将受体腹主动脉离断后，两断端分别与供肠腹主动脉桥两端行端端套管吻合，供体门静脉重建方法同单套管法。与单套管法相比，此法在缩短门脉重建时间的基础上，进一步缩短了供肠动脉的重建时间，同时大大降低了动脉吻合口相关并发症的发生，建模成功率得到进一步提高[32]。另外一种更符合“原位”小肠移植的三套管法在采用相同动脉重建的基础上，将供肠的门静脉与受体门静脉行套管吻合，此法虽然更符合生理持征[33-36]，也更符合原位移植的理念，但是术后存活率等各方面的指标与通过肾静脉回流者相比无明显差异[37]。

套管法相对于手工吻合有其独特的优势，而血管套管作为一种异物，长期存在可导致血管吻合口附近形成纤维化、肉芽肿以及侧支循环等，因此，血管套管吻合更适用于短期研究中动物模型的建立[38]。

3 术中输血及补液

麻醉过程中血管床扩张、手术创面蒸发、术中出血以及移植肠缺血/再灌注损伤导致血管床通透性进一步增大，使得受体大鼠极易发生低血容量性休克。因此，保证充分的血容量是手术成功的重要因素之一。封闭群大鼠间的相互输血及交叉配血实验证明其血型符合且不会出现输血反应[25]。研究表明，术中给予受体和供体特异性输血，不仅可以维持血容量、胶体渗透压及血流动力学的稳定[39]，提高手术成功率，同时还能够减轻大鼠小肠移植术后排斥反应的发生及其程度[40-41]。除输血外，充分补液也是维持受体血容量的一个重要手段。可通过尾静脉、阴茎背静脉以及皮下等进行补液[42-43]，补液量通常为 2 ～ 4 ml[44]。另有研究人员认为术中补液应更加充分，其研究结果发现通过静脉通路补液6 ml，可使得术后3 d存活率由72%提高到90%，因此，充分补液对提高大鼠小肠移植存活率十分重要[28]。

此外，体温也是影响受体存活的重要因素之一。长时间的手术操作导致热量丢失过多，加之移植物再灌注前的低温保存，极易造成受体术后体温过低，复苏困难甚至死亡。关腹前应用温盐水冲洗腹腔使其复温，术后及时复温并采取保温措施可促使受体及早复苏。总之，建立稳定、可复制性强、生存时间较长的大鼠小肠移植模型可为下一步进行深入研究奠定基础。