乳品加工中嗜热杆菌生物膜特性及其危害

张梦娇，李 妍，2，*（.北京工商大学，北京市食品添加剂工程技术研究中心，食品质量与安全北京实验室，北京00048；2.食品安全与营养协同创新中心，东北农业大学，黑龙江哈尔滨50030）

乳品加工中嗜热杆菌生物膜特性及其危害

张梦娇1，李 妍1，2，*
（1.北京工商大学，北京市食品添加剂工程技术研究中心，食品质量与安全北京实验室，北京100048；2.食品安全与营养协同创新中心，东北农业大学，黑龙江哈尔滨150030）

嗜热杆菌是乳制品加工中的主要污染菌，影响产品的品质和安全性。在加工生产线上形成生物膜是嗜热杆菌污染乳制品的主要原因。本文综述嗜热杆菌的生物膜形成的特点、危害及其可能的防范措施，为乳制品生产及相关领域的研究工作提供参考。

嗜热杆菌，生物膜，乳制品

嗜热杆菌（Thermophilic Bacilli）是包括乳制品在内的许多食品加工中的主要污染菌［1］。它们能够在较高的温度（40～70℃）下存活并生长。乳品生产线中的稀奶油分离、杀菌机的预热段和蒸发浓缩段的操作温度适宜嗜热菌生长，它们可附着在生产线中形成生物膜，造成乳制品严重污染［2-4］。本文综述嗜热杆菌的生物膜形成的特点、危害及其可能的防范措施，为乳制品生产及相关领域的研究工作提供参考。

1 乳品中的嗜热杆菌

乳制品工业中主要采用55℃培养的方法检测和分离嗜热杆菌。此法分离到的嗜热杆菌包括专性嗜热菌和兼性嗜热菌两类。专性嗜热菌只能在较高温度下（40～68℃）生长，主要包括黄热芽孢杆菌（Anoxybacillus flavithermus）、地芽孢杆菌（Geobacillus spp.）［2］。兼性嗜热菌主要是芽孢杆菌属的细菌，其在中温和高温下都能生长，包括地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、耐热芽孢杆菌（Bacillus sporothermodurans）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等［2］。

多数嗜热杆菌能产生耐热芽孢，乳制品加工常用的巴氏杀菌不能将其杀死［5］，有些芽孢甚至可以经受超高温瞬时（UHT）灭菌（140～145℃，2～5 s）而存活［6］。

2 嗜热杆菌的生物膜

2.1 嗜热杆菌生物膜的形成

生物膜是微生物细胞与其产生的胞外多糖（EPS）缔结，粘附并在无活性或活体表面生长，形成的具有一定结构的微生物聚集体，嗜热杆菌生物膜的形成与其他细菌相似，通常经过一系列过程：首先菌体细胞通过范德华力、静电作用力和疏水相互作用力等附着于基质表面，形成初始的可逆粘附［7］。随后通过产生胞外多糖或其他细胞表面结构与基质形成复合体，从而将细胞固定在表面上，形成不可逆粘附［8］。一旦细胞粘附在表面上，即产生胞外多糖并开始形成微生物群落。这些群落继续扩大，在EPS基质中形成多层复合的菌体细胞，EPS基质中也会形成水分通道［9］，这种基质可以给菌体细胞提供营养来源。粘附过程和EPS的产生使生物膜内的菌体细胞比悬浮细胞对不良环境的抵抗力更强［10］。

嗜热杆菌生物膜的形成过程因菌株和环境的不同而不同。乳制品加工领域中的嗜热杆菌粘附及其生物膜形成机制还不明确，目前研究主要集中于菌体自身性质及不同环境条件对嗜热杆菌的粘附并形成生物膜的影响。一些基于A.flavithermus和Geobacillus spp.的研究发现营养体和芽孢的粘附可促使嗜热杆菌生物膜形成，在不锈钢表面的粘附是其形成生物膜的关键［11］。Parkar等研究证实一系列嗜热杆菌，包括Geobacillus、Anoxybacillus、B.licheniformis、B.coagulans和B.pumilus能够以相同数量附着在不锈钢表面和乳垢上，并且芽孢比营养体更容易粘附［12］。

2.2 嗜热杆菌生物膜的特点

游离的嗜热杆菌附着于设备表面一段时间后方可适应粘附状态并开始生长形成生物膜，而菌体从生物膜中释放的速度并不滞后于其在生物膜中的生长速度，甚至比原代细胞增长更迅速，这与其他细菌的生物膜相似［13］。

有研究认为，细菌形成生物膜的动力及生存优势主要包括以下几方面［14］：一是对有害条件的防御：减少湍流和冲刷的影响；保护其免受环境中可能的毒素、抗生素、清洁剂和消毒剂的伤害。二是定植于游离位置：胞外酶的扩散减少，表面上营养物质浓度的增加。三是形成群落并利用群落的潜在优势：可能通过细菌细胞间的信号转导来传递遗传信息，包括其抗性基因。

混合菌种的生物膜可能比单一菌种的更稳定［15］，这在适合多菌种生长的加工环境中是很重要的。在混合菌种形成的生物膜中，除细菌细胞外，还有多种真核细胞、胞外多糖（EPS）、酶和其他蛋白质、细菌素、低分子质量的溶质，以及细胞裂解产生的核酸［16］。

2.3 影响生物膜的因素

菌体细胞表面的物理化学特性影响菌体的粘附进而影响生物膜的形成，对于这方面的研究还存在一定的争议。Faille等发现B.cereus的芽孢在没有外壁的情况下对不锈钢的粘附能力有所降低［17］，但Parkar等观察到除掉A.flavithermus和Geobacillus spp.芽孢的外部蛋白质层时，其对不锈钢的粘附能力没有明显降低［12］。有研究认为芽孢的疏水性越大，粘附性就越强［2］。但Seale等研究来自乳粉的Geobacillus菌株的物理化学特性时却发现其所研究的菌株芽孢自然情况下大多数呈亲水性（pH6.8），且带负电荷最低、最亲水的芽孢在不锈钢表面的粘附数量最高［18］。Parkar等的研究也得出嗜热杆菌的芽孢粘附性与疏水性之间并不相关的结论［12］。Palmer等研究发现A.flavithermus的营养体细胞对不锈钢表面的粘附可能与其细胞的表面蛋白有关，除去一株A.flavithermus菌的表面蛋白则导致其在不锈钢表面的粘附性降低1个log值［19］。进一步研究发现一株粘附能力比其母系株降低了10倍的A.flavithermus突变株的疏水性低于母系株。Palmer还发现EPS对于嗜热杆菌的表面粘附影响不大，去除EPS的菌株粘附能力并没有降低［19］。

环境条件的变化对于嗜热杆菌芽孢生成和生物膜特性影响较大。55℃和60℃下生长8 h的生物膜中A.flavithermus芽孢所占的比例达到10%～50%，而48℃下生物膜中则检测不到芽孢的存在［20］。Parkar等采用物理和化学处理的方法分析了A.flavithermus生物膜对环境条件变化的稳定性，发现pH、机械振动和抑菌素等都不同程度影响生物膜的活性和稳定性［21］。

3 对乳制品加工的危害

3.1 造成产品嗜热菌污染

嗜热芽孢杆菌能形成抗逆性强的芽孢，具有形成生物膜的能力、较高的生长和繁殖速度、较宽的生长温度范围，都使其在加工过程中难以被消除［3］，并且其形成的生物膜作为污染物的存储库，使工厂不能彻底清洗［22］，原位清洗能够清除生产线中游离的营养体和芽孢，但生物膜中的菌体则会留在设备中对下一次生产造成污染［23］。已有研究证实嗜热杆菌能够在乳品加工设备表面形成生物膜并能够在奶垢层中生长，如果生产周期过长，加工设备清洗不当，或者产品在生产线中多次循环处理等，就会造成嗜热菌的过度生长，因而造成产品的污染问题［2-3］。

3.2 腐败乳制品酶的来源

生物膜也可能成为一个没有意识到的导致乳制品腐败的酶的来源。有研究发现从原料乳贮罐分离到的细菌生物膜可以释放蛋白酶和脂肪酶［24-26］。嗜热杆菌能够产生耐热的腐败乳制品酶，在其生物膜生长过程中也有释放酶造成产品潜在腐败的可能［27］。

有研究表明，来自污染奶粉生产线的七株嗜热芽孢杆菌能产生胞外和胞内的蛋白酶和脂肪酶［28］。并且这些酶高度耐热，足以在乳品生产中经受任何热处理而在终产品中保持活性，造成产品的腐败。

3.3 毒素的来源

一些嗜热芽孢杆菌能产生毒素，例如地衣芽孢杆菌［29］和枯草芽孢杆菌［30］的某些菌株，能产生与蜡样芽孢杆菌中cereulide类似的毒素，是一种小分子肽类的致呕吐毒素。有研究发现有些地衣芽孢杆菌菌株与食物中毒事件的原料奶和婴儿食品有关［31］。对7种嗜热芽孢杆菌的101株菌进行热稳定毒素生产的研究发现，巨大芽孢杆菌（B.megaterium）、坚强芽孢杆菌（B.firmus）、简单芽孢杆菌（B.simplex）都能产生不同的热稳定毒素，表现出不同水平的毒性［29］。如果这些芽孢杆菌在乳品生产线中形成生物膜，则在条件适宜的条件下可能释放毒素污染产品。

4 可能的控制措施

目前乳制品加工中防止嗜热芽孢杆菌滋生及形成生物膜的手段主要有以下几方面：

4.1 缩短生产时间，增加清洗频率

在表面有嗜热杆菌的不锈钢表面，嗜热杆菌的生物膜在6 h即可达到106个/cm2的成熟生物膜水平，而经巴氏杀菌的脱脂乳在适宜温度下18 h可达到同样水平［21］，因此缩短生产线连续运行时间，增加清洗，可以防止嗜热菌形成生物膜。通常牛奶连续处理时长限制在6～8 h，乳粉厂通常将连续生产时长限制在18～24 h［2］。

4.2 原位清洗，协同杀菌

原位清洗（clean in place，CIP）去除牛奶加工线生物膜的能力仍然很有争议。CIP清洗后的表面即使看上去是清洁的，但微生物仍可能留在表面。有报道从CIP碱洗后的乳品中分离出多种嗜热芽孢杆菌［32］。微生物群落常常由不同耐药机制的几种微生物组成，因此生物膜的消除可以组合使用不同方式进行处理，如CIP清洗与消毒剂，或不同种消毒剂协同使用。协同杀菌处理已有许多报道，其杀菌效果比预测的每种方法总和更强［33］。

4.3 改变加工温度或减小最适生长温度区域的表面积

研究发现，改变环境温度可有效控制嗜热杆菌的生长和产芽孢，例如将生长环境温度从55℃降到48℃能防止生物膜中A.flavithermus形成芽孢［20-21］。因此降低或提高加工中适宜嗜热菌滋生段的加工温度能抑制嗜热杆菌的生长及形成生物膜。将奶油分离的温度从50℃以上降低到45℃以下（约15～30℃）可以延长生产周期并降低嗜热菌污染。减少最适生长温度区域的表面积也经常用于控制嗜热杆菌生长［34-35］。例如采用直接注入蒸汽法（direct steam injection，DSI）替代间接加热系统可降低杀菌预热段的换热接触面积，蒸汽能迅速增加牛奶的温度，避免嗜热菌在最适生长温度生长。

4.4 双设备交替使用

在嗜热菌容易生长的工序使用双设备系统，例如使用双预热系统，其中的牛奶从一个预热器经过8～12 h生产后奶液直接进入第二个预热器，此时可对第一个预热器进行CIP清洗而不影响正常的生产周期。

5 展望

嗜热杆菌能够在乳品加工生产线中形成生物膜的特性，严重威胁着乳制品的品质。已有研究证实，国产乳粉中嗜热菌污染严重，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、黄 热 芽 孢 杆 菌（Anoxybacillus flavithermus）和嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）是主要污染菌［36-37］。目前乳制品加工领域嗜热菌粘附和形成生物膜的机制还不明确，因此对于这方面的研究亟待深入，以便更好地了解嗜热菌在食品加工中造成产品污染的途径和方式，从而更有针对性的制定有效的防范措施。

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Biofilm characteristics and harm of Thermophilic Bacillus in dairy products

ZHANG Meng-jiao1，LI Yan1，2，*
（1.Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives，Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China；（2.Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Thermophilic Bacillus was the main contaminating bacteria during the process of dairy products.It affects quality and safety of the product.The formation of biofilm was the main reason for Thermophilic Bacillus to contaminate dairy products.Formation features，hazards and precautionary measures of Thermophilic Bacillus biofilm were reviewed in this paper，providing a future reference for the research of dairy production and its related fields.

Thermophilic Bacilli；biofilm；dairy products

TS201.1

A

1002-0306（2016）06-0388-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.069

2015－07－27

张梦娇（1992-），女，硕士研究生，研究方向：乳制品加工技术，E-mail：647yang@163.com。

李妍（1977-），女，博士，研究方向：乳制品加工技术，E-mail：yanyan.9999@163.com。

国家自然基金青年科学基金（31401517）；现代农业（奶牛）产业体系建设专项（CARS-37）；北京市属高等学校创新团队建设与教师职业发展计划项目（IDHT20130506）。