低氧对大鼠前额叶皮层AQP4蛋白和HIF-1α蛋白表达的影响

李　敏，董子玉，陈学群



低氧对大鼠前额叶皮层AQP4蛋白和HIF-1α蛋白表达的影响

李敏，董子玉，陈学群

目的探讨在低氧条件下SD大鼠前额叶皮层AQP4蛋白和HIF-1α蛋白的表达，为阐明低氧脑水肿的发病机制提供依据。方法将12只SD大鼠随机分为常氧组和低氧组，低氧组大鼠在低氧舱中模拟高原海拔7 000 m低氧(7.8% O2)中暴露8 h，通过Western blot检测大鼠前额叶皮层AQP4蛋白和HIF-1α蛋白的表达。结果在海拔7 000 m低氧暴露8 h后，SD大鼠前额叶皮层AQP4蛋白和HIF-1α蛋白表达增多(P<0.05)。结论SD大鼠前额叶皮层AQP4蛋白和HIF-1α蛋白在模拟高原海拔7 000 m低氧8 h后表达升高，提示HIF-1可能通过上调AQP4蛋白的表达参与了低氧脑水肿的发生。

低氧；脑水肿；水通道蛋白4；低氧诱导因子-1

人体的脑组织耗氧量大，对缺氧十分敏感，急性低氧可使脑组织水分异常过度集聚引起脑水肿。低氧脑水肿发生时脑体积增大、颅内压升高，发展十分迅速，是可导致死亡的危急病症[1]，如高原低氧环境可诱发脑水肿[2]。水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一类广泛分布于机体不同组织器官中的特异性跨膜转运水的膜蛋白，其中水通道蛋白4(AQP4)主要分布于脑组织中，在生理和病理状态下均参与细胞中水的转运，在脑组织水平衡调节中起关键作用[3]。低氧条件下广泛存在于各种人体细胞中的低氧诱导因子-1(hypoxia induced factor-1,HIF-1)是一种核转录调节因子，对机体低氧环境适应和调控起关键作用。本文模拟急性高原低氧环境，研究低氧脑水肿时AQP4蛋白和HIF-1α蛋白表达变化，探讨低氧暴露时脑组织的损伤，为阐明低氧脑水肿的发病机制提供实验依据。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组雄性健康清洁级Sprague-Dawley大鼠，体质量(170±15) g，购自浙江省医学科学院实验动物中心。实验动物随机分为常氧对照组和7 000 m(7.8%O2)低氧组，每组各6只。

1.2主要试剂及仪器蛋白裂解液(RIPA)、BCA法测定蛋白试剂盒与ECL化学发光试剂(上海碧云天生物技术研究所)，BSA(Biosharp，China)，蛋白Marker(Thermo Fisher Scientific，USA)，兔源AQP4多克隆抗体(Merck Millipore，Germany)，小鼠源HIF-1α单克隆抗体(Novus Biologicals，USA)，内参GAPDH单克隆抗体(上海康成生物公司)，其他常规溶液为国产分析纯试剂配制；低氧舱(贵州风雷航空军械有限责任公司)，台式冷冻离心机(Heraeus Biofuge Stratos，USA)，0.45 μm PVDF膜(Merck Milipore,Germany)，蛋白电泳仪器和凝胶成像系统(Bio-rad,USA)。

1.3低氧处理实验大鼠分为常氧对照组和低氧实验组。常氧对照组大鼠处于浙江省杭州市海拔100 m，含氧量20.9%，大气压为100.08 kPa。低氧实验组大鼠置于低氧舱(1 m3)中以250 m· min-1速度升至所需海拔高度7 000 m(7.8%O2)，暴露低氧8 h。对照组大鼠放置于另一形状大小相同的低氧舱中，但不给予低氧。

1.4脑含水量测定在低氧结束后迅速将大鼠取出断头牺牲，并迅速分离取出全脑，称量湿重，然后将其置于120 ℃烤箱内，24 h烘至恒重后再称量全脑干重。脑含水量计算公式为：[(湿重-干重)/湿重]×100%，按照该公式计算脑含水量百分比。

1.5蛋白提取低氧结束后大鼠出舱断头牺牲后，迅速取出大脑，用刀片取前额叶皮层约30 mg，置于配制好并且4 ℃预冷的裂解液中，然后匀浆提取蛋白。匀浆结束后，14 000 g 4 ℃离心20 min，取上清，分装后于-20 ℃保存。1.6电泳和免疫印迹8% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳时采用3%浓缩胶80 V 30 min，8%分离胶120 V 100 min。200 mA转膜2 h后，PVDF膜用TBST配制的5% BSA 37 ℃封闭2 h，然后再用PVDF膜分别和兔抗AQP4抗体(1∶2 000)、小鼠抗HIF-1α抗体(1∶500)和小鼠抗GAPDH抗体(1∶5 000)杂交，水平摇床4 ℃过夜(14～16 h)。TBST洗膜后PVDF膜再分别和相应的辣根过氧化物酶二抗山羊抗兔(1∶2 000)和山羊抗小鼠(1∶5 000)37 ℃孵育1 h。TBST再次洗膜后，将膜至于ECL中曝光，显影，定影。

1.7分析采用Bio-Rad凝胶成像系统软件对Western blot 结果进行分析。

2　结果

2.1低氧诱导大鼠脑水肿形成低氧8 h(模拟海拔7 000 m，7.8%O2)诱导大鼠脑含水量增加,常氧组为(76.46±0.42)%，低氧组为(78.01±0.57)%，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.1低氧诱导前额叶皮层AQP4蛋白表达增加与常氧对照组比较，低氧8 h(模拟海拔7 000 m，7.8%O2)大鼠前额叶皮层AQP4蛋白表达升高[常氧组：(58.86±6.14)%；低氧组：(101.02±16.87)%]，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2低氧诱导前额叶皮层HIF-1α蛋白表达增加Western blot 实验结果显示：HIF-1α蛋白在大鼠前额叶皮层中有基础表达，在低氧(模拟海拔7 000 m，即7.8%O2，8 h)处理后大鼠前额叶皮层中HIF-1α蛋白表达升高[常氧组：(11.20±2.75)%；低氧组：(20.04±3.78)%]，差异有统计学意义(P<0.05)。

3　讨论

低氧时HIF-1通过与低氧反应相关基因的低氧反应原件(hypoxia react factor，HRE)结合诱导下游靶基因，来介导低氧反应，调控机体的无氧代谢，使细胞能够耐受低氧状态而存活下来[4]。HIF-1由α和β两个亚基组成，其中HIF-1α受氧浓度调节，是调节HIF-1活性的功能亚单位，与机体的急性低氧反应有关[5]。核磁共振结果显示模拟高原海拔4 000 m低氧8 h即可以引起Wistar大鼠出现脑水肿，且随着低氧程度加深，脑水肿也逐步加重[6]，SD大鼠在模拟高原海拔7 000 m低氧8 h后也出现脑水肿[7]。据报道，10 d新生大鼠颈动脉单侧暂时性结扎24 h后梗死区形成脑水肿，免疫组化显示梗死区域AQP4蛋白表达明显上升[8]。AQP4参与脑组织的水调节，广泛表达在神经胶质细胞中，在维持大脑的水平衡中起重要作用。在大鼠脑出血后的6 h，脑内含水量和血肿周围的AQP4蛋白表达增加，且AQP4蛋白表达量与脑内含水量呈现正相关[9]。在水中毒脑水肿模型中，AQP4基因敲除小鼠脑组织含水量显著减轻，生存能力增强，说明AQP4不仅参与了脑水肿的形成，并且起着重要的水调节作用[10]。本研究显示，模拟高原海拔7 000 m低氧8 h促进大鼠前额叶皮层AQP4蛋白表达明显升高，说明AQP4表达增多在急性低氧脑水肿的形成过程中起重要作用。

HIF-1作为转录因子，低氧时广泛表达在脑、肾、肝和心脏等多种组织细胞中，是低氧状态下细胞应答的重要物质。HIF-1α在常氧下半衰期<1 min，极易降解，但低氧下HIF-1α转录活性和稳定性都显著增加[11]。同时低氧还可诱导HIF-1α蛋白集聚并且使HIF-1α与DNA结合的活性增加，激活下游的低氧相关靶基因[12]。Western blot和免疫组化结果显示全脑缺血可以诱导大鼠皮层、海马HIF-1α蛋白表达增多[13]。Bernaudin发现新生大鼠在8%O2低氧3 h后脑内HIF-1α表达显著升高[14]。有研究证明利用RNA干扰技术抑制HIF-1α蛋白产生则可以有效减少大鼠的缺血损伤[15]。本研究发现，大鼠模拟海拔7 000 m 8 h急性低氧后前额叶皮层HIF-1α蛋白表达与对照组相比显著升高，这与前述结果一致，提示HIF-1α蛋白表达增多可能与急性低氧诱导的脑水肿有关。

综上所述，模拟海拔7 000 m急性低氧8 h诱导大鼠前额叶皮层AQP4蛋白和HIF-1α蛋白表达显著增加，提示AQP4蛋白和HIF-1α蛋白可能参与了急性低氧诱导的脑水肿，低氧条件下HIF-1可能通过对下游相关靶基因的调节上调AQP4蛋白的表达引起脑水肿。

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Effect of Hypoxia on Expression of AQP4 and HIF-1α in Protein in Prefrontal Cortex of Rats

LI Min,DONG Zi-yu,CHEN Xue-qun

(Xinyang Vocational and Technical College,Xinyang 464000,China)

ObjectiveTo investigate the expression of AQP4 and HIF-1α protein in the prefrontal cortex of SD rats under hypoxic conditions for the basis of elucidating the mechanism of hypoxic brain edema.MethodsTwelve SD rats were randomly divided into the normal oxygen group and the hypoxia group.Rats in hypoxia group were exposed to hypoxia (7.8% O2，equal to 7 000 m altitude) in a hypobaric chamber for 8 h.The expression of AQP4 and HIF-1α protein in rat prefrontal cortex were determined by Western blot.ResultsAQP4 and HIF-1α protein were enhanced in the hypoxic rat prefrontal cortex after exposure to 7 000 m hypoxia for 8 h (P<0.05) by Western blot.ConclusionThe expression of AQP4 and HIF-1α protein in the prefrontal cortex of SD rats were increased after 8 h hypoxia.It was showed that HIF-1 might contribute to hypoxic brain edema by increasing the expression of AQP4 protein.

hypoxia；brain edema；aquaporin 4; hypoxia induced factor-1；HIF-1α

1672-688X(2016)03-0174-03DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.03.004

2016-05-10

信阳职业技术学院，河南信阳 464000

李敏(1987-)，女，河南信阳人，讲师，从事生理学教学工作。

陈学群，女，教授，博士生导师，E-mail：chewy@zju.edu.cn

R364.4,R338.2+5

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