内皮素-1在心房颤动发生中的机制探讨

洪钰杰，钟国强，蒋智渊，方曙，孙培震



内皮素-1在心房颤动发生中的机制探讨

洪钰杰，钟国强，蒋智渊，方曙，孙培震

摘要

关键词心房颤动；内皮素-1；心房纤维化

作者单位：530021 广西省南宁市，广西医科大学第一附属医院 心血管内科

Effect of Endothelin-1 on Atrial Fibrosis in Patients With Atrial Fibrillation

HONG Yu-jie, ZHONG Guo-qiang, JIANG Zhi-yuan, FANG Shu, SUN Pei-zhen.
Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning (530021), Guangxi, China
Corresponding Author: ZHONG Guo-qiang, Email: gq_zhong@126.com

Abstract

Objective: To explore the effect of endothelin-1 on atrial fibrosis in patients with atrial fibrillation (AF).

Methods: A total of 72 patients with thoracotomy were studied, the patients were divided into 2 groups: AF group, n=39 and Sinus rhythm (SR) group, n=33.The mRNA and protein expressions of endothelin-1 (ET-1), platelet derived growth factor-B (PDGF-B) and collagen I (COL1) in right atrial appendage (RAA) tissue were measured by RT-PCR and Western blot analysis; meanwhile, the impact of ET-1 stimulation and non-selective ET-1 receptor antagonist (sulfafurazole SIZ) on PDGF-B mRNA and protein expressions in H9c2 cells were measured.

Results: ①The RAA tissue mRNA and protein expressions in AF group were higher than those in SR group, as for ET-1 (2.830 ± 2.276) vs (1.220 ± 0.887) and (0.835 ± 0.241) vs (0.286 ± 0.083), both P<0.01; for PDGF-B (2.568 ± 2.348) vs (1.567 ± 0.831) and (0.807±0.241) vs (0.381 ± 0.105), both P<0.05; for COL1 α1 (3.376 ± 1.598) vs (1.629 ± 0.833) and (0.652 ± 0.210) vs (0.312 ± 0.12), both P<0.05.②The protein expressions of ET-1 and COL1 had positive correlation (r=0.580, P<0.01).③ET-1 promoted PDGF-B secretion in H9c2 cells in a concentration and time-dependent manner; SIZ could reduce such promotion.

Conclusion: ET-1 plays an important role in AF occurrence which might be related to PDGF-B regulation.

Key words Atrial fibrillation; Endothelin-1; Atrial fibrosis

(Chinese Circulation Journal, 2016,31:146.)

心房颤动（房颤）是临床上最常见的心律失常，致残、致死率高。房颤发病机制复杂，心房重构是其中心环节。心房纤维化作为心房结构重构最显著的特征，与房颤的发生密切相关[1]。大量研究发现，房颤患者心房组织和外周血内皮素-1（ET-1）表达升高[2-5]，但ET-1在房颤发病中的具体作用，目前尚不清楚。已有的研究表明，ET-1与心肌纤维化密切相关[6]，并且ET-1对血小板衍生生长因子（PDGF）具有调控作用[7]。PDGF-B是重要的致心房纤维化因子[8]，ET-1是否通过调控PDGF-B促进心房纤维化而参与房颤的发生？目前尚少见报道。本研究旨在初步探讨ET-1在房颤发生中的作用和可能的作用机制。

1　资料与方法

对象：选择2012-10至2014-06我院心脏外科住院的72例心脏外科手术患者为研究对象，分为房颤组（39例）和窦性心律（窦律）组（33例）。其中，心脏瓣膜病患者61例，房间隔缺损患者6例，冠状动脉粥样硬化性心脏病患者5例。排除标准：（1）合并感染性心内膜炎；（2）合并风湿活动征象；（3）高血压；（4）内分泌紊乱、甲状腺功能亢进；（5）自身免疫性疾病；（6）严重肝肾功能不全、恶性肿瘤；（7）年龄＜18岁；（8）心脏二次手术者。本研究所有入选患者签署书面知情同意书，并获得广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准。

两组患者性别、年龄、基础心脏疾病（除外联合瓣膜病变）、纽约心脏协会（NYHA）心功能等差异无统计学意义，但房颤组患者左心房内径明显大于窦律组（P<0.01），差异有统计学意义。（表1）

右心耳标本获取：于建立体外循环插腔静脉管前，切开右心耳时切取约150 mg右心耳组织，部分放入液氮中冻存，部分用4%多聚甲醛固定。

细胞培养：H9c2细胞系（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）在含有10% 胎牛血清（Gibco），2 mM 谷氨酰胺，100 U/ ml 青霉素和100 μg/ ml链霉素的HG-DMEM 培养基中，37℃，5% CO2环境中培养，倒置相差显微镜观察细胞贴壁和生长情况，待细胞约80%～90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化贴壁的细胞传代，按1:2分瓶接种，每隔48～72 h更换培养基1次。

ET-1干预H9c2细胞：ET-1（PROSPEC）干预前H9c2细胞以无血清培养基同步化24 h。H9c2细胞在含ET-1（0 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L）培养基中分别培养24 h；此后，H9c2细胞在含ET-1 10 nmol/L培养基中，分别培养0 h、24 h、48 h 、72 h；最后，H9c2细胞在含ET-1 10 nmol/L+ SIZ[9]（Sigma，美国）2 mmol/L培养基中培养24 h。

表1　两组患者一般临床资料的比较[例（%）]

右心耳组织马松（Masson）染色：右心耳组织固定后石蜡包埋，制成5 μm石蜡切片，脱蜡、梯度酒精脱水处理，苏木素—伊红染色10 min，Masson复合染液染色5 min，0.2%磷酸钨酸处理切片5～10 min，0.2%醋酸水溶液浸洗2次。亮绿染色5 min，常规无水乙醇脱水、透明及封固，光学显微镜下观察并随机选取5个视野进行拍照。

实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）：（1）组织及细胞总RNA提取： Trizol（Invitrogen）提取组织和细胞总RNA，NanoDrop2000型微量分光光度计测定RNA的OD280/OD260值（1.8～2.0）；（2）cDNA合成：按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （TAKARA）试剂盒说明书操作，进行总RNA逆转录反应；（3）引物设计与合成：人ET-1、PDGF-B、I型胶原α1亚基（COL1α1）和内参照磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物，大鼠PDGF-B和内参照GAPDH引物由日本TAKARA公司设计合成（表2）；（4）荧光定量PCR: 按SYBR®Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）试剂盒（TAKARA）说明书操作，使用ABI 7300荧光定量PCR仪检测人ET-1、PDGF-B、COL1α1，大鼠PDGF-B mRNA相对表达量，结果以2-△△CT表示。

表2　基因引物序列

蛋白免疫印迹（Western blot）检测：提取右心耳组织和细胞总蛋白，各蛋白样孔蛋白上样总量30 μg；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）；湿法转膜；孵育一抗（4℃过夜）：抗ET-1鼠单克隆抗体 (Abcam） 1:500、抗PDGF-B兔单克隆抗体(Abcam） 1：1 000、抗COL1鼠单克隆抗体(Abcam） 1：500、抗GAPDH鼠单克隆抗体（Sigma）1：10 000；孵育二抗（常温1～2 h）：荧光标记羊抗鼠IgG抗体（Licor） 1:10 000、荧光标记羊抗兔IgG抗体（Rockland）1:10 000；Odyssey荧光成像系统扫膜，以GAPDH为内参照，检测人ET-1、PDGF-B、COL1及大鼠PDGF-B蛋白相对表达，结果以目的蛋白条带与相应内参蛋白条带的灰度值比值表示。

统计学分析：采用SPSS 22.0软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，计数资料以率或百分比表示；两组间计量资料比较采用两独立样本的t检验，计数资料比较采用χ2检验；多组间总体均数的比较采用单因素方差分析，多组间均数两两比较，采用q检验；单因素相关分析采用Pearson相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组患者右心耳ET-1表达

房颤组患者右心耳ET-1 mRNA表达水平（2.830±2.276）明显高于窦律组（1.220 ±0.887）（t=4.068，P<0.01）；蛋白表达水平（0.835±0.241）亦明显高于窦律组（0.286±0.083）（t=-13.309， P<0.01），差异均有统计学意义。（图1A）

2.2两组患者右心耳PDGF-B表达

房颤组患者右心耳PDGF-B mRNA表达水平（2.568±2.348）明显高于窦律组（1.567 ±0.831）（t=2.482，P<0.05）；蛋白表达水平（0.807±0.241）亦明显高于窦律组（0.381±0.105）（t=-10.860，P<0.01），差异均有统计学意义。（图1B）

2.3两组患者右心耳COL1表达

房颤组患者右心耳COL1α1 mRNA表达水平（3.376±1.598）明显高于窦律组（1.629±0.833）（t=5.941，P<0.05）；COL1蛋白表达水平（0.652±0.210）亦明显高于窦律组（0.312±0.122） （t=-8.565，P<0.05），差异均有统计学意义。（图1C）

注：AF：房颤组；SR：窦律组；ET-1：内皮素-1；PDGF-B：血小板衍生生长因子-B；COL1：I型胶原；GAPDH: 磷酸甘油醛脱氢酶

2.4ET-1与COL1相关性分析

单因素相关分析显示两组患者右心耳COL1蛋白表达水平与ET-1蛋白表达水平呈明显的正相关（r=0.580，P<0.01），差异有统计学意义。

2.5两组患者右心耳胶原纤维沉积

Masson染色提示房颤组患者右心耳胶原纤维沉积明显多于窦律组患者，呈粗大的束状包裹、分隔心肌纤维。（图2）

图2　两组患者右心耳胶原纤维沉积

2.6ET-1对H9c2细胞PDGF-B分泌的影响

（1）不同浓度ET-1对H9c2细胞PDGF-B mRNA表达的影响：与0 nmol/L（1.043±0.102）比较，1 nmol/L ET-1（1.314±0.131，q=6.335，P<0.01）、10 nmol/L ET-1（1.671±0.131，q=14.687，P<0.01）、100 nmol/L ET-1（1.973±0.145，q=21.737，P<0.01）、H9c2细胞PDGF-B mRNA表达水平明显升高，且1 nmol/L、10 nmol/L (q=8.352，P<0.01）、100 nmol/L (q=7.050，P<0.01） PDGF-B mRNA表达水平进行性升高，差异有统计学意义。

（2）不同浓度ET-1对H9c2细胞PDGF-B蛋白表达的影响：与0 nmol/L（0.070±0.028）比较，1 nmol/L ET-1（0.163±0.025，q=7.111，P<0.01）、10 nmol/L ET-1（0.355±0.043，q=21.792，P<0.01）、100 nmol/L ET-1（0.623±0.053，q=42.267，P<0.01）H9c2细胞PDGF-B蛋白表达水平明显升高，且1 nmol/L、10 nmol/L (q=14.681，P<0.01）、100 nmol/ L（q=20.475，P<0.01）PDGF-B蛋白表达水平进行性升高，差异有统计学意义。(图3）

图3　不同浓度ET-1对H9c2细胞PDGF-B蛋白表达的影响

（3）ET-1培养不同时间对H9c2细胞PDGF-B mRNA表达的影响：与0 h（0.966±0.131）比较，24 h（1.671±0.131，q=13.151，P<0.01）、48 h（1.999±0.178，q=19.277，P<0.01）、72 h （2.278±0.194，q=24.462，P<0.01）H9c2细胞PDGF-B mRNA表达水平明显升高，且24 h、48 h （q=6.126，P<0.01）、72 h（q=5.185，P<0.01）PDGF-B mRNA表达水平进行性升高，差异有统计学意义。

（4）ET-1培养不同时间对H9c2细胞PDGF-B蛋白表达的影响：与0 h（0.069±0.019）比较，24 h（0.355±0.043，q=23.428，P<0.01）、48 h （0 .6 2 8±0 .0 3 8，q = 4 5 .7 6 9，P< 0 .0 1）、72 h（0.750±0.041，q=55.721，P<0.01） H9c2细胞PDGF-B蛋白表达水平明显升高，且24 h、48 h（q=22.341，P<0.01）、72 h（q=9.952，P<0.01）PDGF-B蛋白表达水平进行性升高，差异有统计学意义。（图4）

图4　ET-1培养不同时间对H9c2细胞PDGF-B蛋白表达的影响

（5）内皮素拮抗剂对ET-1培养下H9c2细胞PDGF-B表达的影响：与10 nmol/L ET-1比较，ET-1 10 nmol/L+ SIZ 2 mmol/L的H9c2细胞PDGF-B mRNA表达水平（1.426±0.130）明显下降（t=3.633，P<0.01）；PDGF-B蛋白水平（0.246±0.022）也明显下降（t=6.510，P<0.01），差异均有统计学意义。（图3）

3　讨论

内皮素是一种由21个氨基酸残基组成的活性多肽，主要由内皮细胞分泌，心肌细胞和成纤维细胞等也有一定表达。ET-1是人体最主要的内皮素，它促进成纤维细胞向肌样成纤维细胞分化，增加细胞外基质合成，是导致心肌纤维化的重要因素[6，10-12]。

近来，ET-1在房颤发病中的作用越来越受重视。Zakeri 等[3]研究表明，与单纯的心力衰竭患者相比，合并房颤者血浆ET-1表达更高。Abed等[13]研究发现，随着山羊体重的增加，其心房ET-1及内皮素受体ETA和ETB表达增加，房颤发生的风险明显升高。Mayyas等[14]发现通过饮食补充ω3不饱和脂肪酸可以减少实验犬心脏术后房颤的发生，并且降低血浆ET-1表达。Nakazawa等[15]发现术前血浆ET-1表达水平是预测环肺静脉消融术后3～6个月复发率的重要指标。Latini等[16]也发现，房颤时血浆ET-1前体肽增加，是预测房颤复发的良好指标。上述研究的共同特点在于，房颤时血浆或是心房ET-1表达明显升高，可见ET-1过度表达在房颤发病中起着重要作用。遗憾的是，上述研究均未对ET-1在房颤发病中的具体作用进行深入的研究。

我们的研究发现，房颤组患者右心耳ET-1、COL1表达以及胶原纤维沉积均明显高于窦律组，且两组患者右心耳COL1表达水平与ET-1表达水平呈明显的正相关，提示ET-1可能通过促进心房纤维化而参与房颤的发生。Mayyas等[4]研究结果与我们的研究相似，他们发现器质性心脏病患者左心耳ET-1表达水平与左心房大小、心房纤维化程度以及房颤的发生有明显的相关性。

我们的研究还发现，ET-1可以促进H9c2细胞PDGF-B mRNA和蛋白的合成，并且表现出浓度依赖性和时间依赖性。SIZ可以减弱ET-1对H9c2细胞PDGF-B合成的促进作用。上述结果表明ET-1可在基因转录水平对PDGF-B信号通路进行调控。

PDGF是多种间充质来源细胞（如成纤维细胞、血管平滑肌细胞等）的主要丝裂原，促进间充质细胞生长、迁移、增殖、分化及细胞外基质的合成，在组织损伤后修复中起着重要作用。但病理状态下，过度激活的PDGF可使成纤维细胞转化为肌样成纤维细胞，分泌多种细胞外基质，导致心房纤维化，促进房颤的发生[8]。PDGF主要以旁分泌的形式作用于其效应细胞，其受体（PDGFR）在成纤维细胞高度表达[17]，因此心房成纤维细胞是PDGF最主要的效应细胞之一。据此我们推测，ET-1可能通过刺激心房肌细胞合成PDGF-B，并以旁分泌的形式作用于心房成纤维细胞，促进其分泌细胞外基质，导致心房纤维化和房颤的发生。

我们的研究表明，ET-1可能通过上调PDGF-B促进心房纤维化而参与房颤的发生，有望为房颤的干预提供新的靶点。但目前只是体外实验的结果，有待于体内实验进一步验证。另一方面，由于病例数有限，研究中大部分为心脏瓣膜病患者，仅有少部分为非心脏瓣膜病患者，ET-1在非瓣膜病性房颤中的作用是否如此，仍有待考证。进一步收集病例，探讨ET-1在不同基础心脏疾病房颤发生中的作用，将更加有利于问题的阐明。此外，ET-1促进心肌细胞PDGF-B分泌的具体机制仍有待进一步探索，我们将在今后的研究中逐步完善。

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（编辑：漆利萍）

收稿日期：（2015-05-20）

中图分类号：R54

文献标识码：A

文章编号：1000-3614（2016）02-0146-05

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.02.011

作者简介：洪钰杰 硕士研究生 主要从事心律失常的基础与临床研究 Email：15077177145@163.com 通讯作者：钟国强Email：gq_zhong@126.com

基金项目：广西自然科学基金项目(2013GXNSFAA019167) ；国家自然科学基金课题地区科学基金项目(81460057)

目的：探讨内皮素-1（ET-1）在心房颤动（房颤）和心房纤维化中的作用。

方法：72例开胸手术患者，分为房颤组（39例）和窦性心律（窦律）组（33例）。实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）及蛋白免疫印迹（Western blot）分别检测两组患者右心耳ET-1、血小板衍生生长因子-B（PDGF-B）、I型胶原（COL1）mRNA和蛋白表达水平。同时，检测ET-1刺激以及非选择性ET-1受体拮抗剂（磺胺异恶唑，Sulfafurazole，SIZ）对H9c2细胞PDGF-B mRNA和蛋白表达水平的影响。

结果：（1）房颤组患者右心耳ET-1 mRNA表达水平和蛋白表达水平明显高于窦律组（2.830±2.276 vs 1.220 ±0.887）和（0.835±0.241 vs 0.286±0.083），P均<0.01。房颤组患者右心耳PDGF-B mRNA表达水平和蛋白表达水平明显高于窦律组（2.568±2.348 vs 1.567±0.831）和（0.807±0.241 vs 0.381±0.105），P均<0.05。房颤组患者右心耳I型胶原α1亚基（COL1α1） mRNA表达水平（3.376±1.598） 明显高于窦律组（1.629±0.833），P<0.05；蛋白表达水平（0.652±0.210）亦明显高于窦律组（0.312±0.122），P<0.05。（2）两组患者右心耳I型胶原蛋白表达水平与ET-1蛋白表达水平呈明显的正相关（r=0.580，P<0.01）。（3）ET-1促进H9c2细胞分泌PDGF-B，并表现出浓度和时间依赖性。SIZ可减轻上述效应。

结论: ET-1在房颤的发生中起着重要作用，其可能通过调控PDGF-B促进心房纤维化而导致房颤的发生。