UPLC-QTOF-MS技术分析马家柚果肉成分

万春鹏周油涌陈金印

（1.江西农业大学江西省果蔬保鲜与无损检测重点实验室，江西南昌330045；2.江西柚色天香农业科技开发有限公司，江西上饶334606）



UPLC-QTOF-MS技术分析马家柚果肉成分

万春鹏1周油涌2陈金印1

（1.江西农业大学江西省果蔬保鲜与无损检测重点实验室，江西南昌330045；2.江西柚色天香农业科技开发有限公司，江西上饶334606）

摘要：本文采用超高压液相色谱-四级杆飞行时间质谱（UPLC-DAD-QTOF-MS）对马家柚果肉中的化学成分进行分析。采用反相Agilent C18（50mm×2.1mm，1.8μm）色谱柱，甲醇与水（含0.1％甲酸）二元线性梯度洗脱，检测波长340nm，流速0.25mL/min，柱温25℃；以6538 UHD Accurate-MS Q-TOF LC/MS质谱仪进行检测。通过得到的样品电喷雾-质谱（ESI-MS）负离子扫描模式下的准分子离子峰、碎片信息（Product ions）、保留时间（TR）、紫外色谱图（λmax nm）等信息，查阅相关文献，对11种化学成分进行初步解析，推测为（1）柠檬酸、（2）圣草素-7-O-葡萄糖甙、（3）芹菜素-6-C-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷、（4）新圣草枸橼苷、（5）柚皮素-7-O-葡萄糖苷、（6）柚皮苷、（7）新橙皮苷、（8）乙酰柚皮苷、（9）野漆树甙、（10）山柰酚7-O-鼠李糖3-O-鼠李糖苷和（11）柚皮素。其中柚皮苷为马家柚中主要的黄酮苷类成分。

关键词：马家柚；化学成分；UPLC-QTOF-MS

马家柚是产于江西省广丰县境内的一个红心柚品种，是当地的一种特色产品，具有果大、形美、耐储运、果肉细嫩、色泽浅红、甜度适中以及出汁率高等优点，被誉为“江西省酸柚类第一名”的荣誉称号[1]。马家柚种植历史悠久、品质优、保健功能成分含量高，是一种高档的保健柚。

马家柚全身上下都是宝，柚皮可以入药，具有消食和胃、理气、化痰、解酒毒等功效，还可以加工成休闲食品；果肉可以鲜食，还可以加工成果汁、果酒等；柚子花因其有类似茉莉花的香味可以制作成花茶；柚子核含有丰富的柠檬苦素类化合物，具有一定的抗癌、抗病毒及其它有益生物活性。柚果肉中主要含有以β-柠檬烯为主的挥发性香气成分[2]、以柚皮苷为主的黄酮类活性成分[3]。

然而，目前对马家柚的研究仅限于栽培技术[4]、品质[5]和采后贮藏保鲜[6]等方面，对其活性成分的研究还未见系统报道。为了阐明其保健功效的物质基础，本文利用UPLC-DAD-QTOF-MS对马家柚果肉提取物的化学成分进行了系统的研究。采用负离子扫描模式，由准分子离子峰、碎片信息结合紫外特征吸收、色谱保留时间，通过查阅其它柚类成分研究相关报道文献，初步鉴定了马家柚果肉中11种化学成分，主要为黄酮糖苷类化合物，它们分别是：（1）柠檬酸、（2）圣草素-7-O-葡萄糖甙、（3）芹菜素-6-C-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷、（4）新圣草枸橼苷、（5）柚皮素-7-O-葡萄糖苷、（6）柚皮苷、（7）新橙皮苷、（8）乙酰柚皮苷、（9）野漆树甙、（10）山柰酚7-O-鼠李糖3-O-鼠李糖苷和（11）柚皮素。UPLC-DAD-QTOF-MS技术可以用于快速鉴定马家柚果肉中的化学成分。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

马家柚，2014年12月采自江西省广丰县，2015年3月由江西柚色天香农业科技开发有限公司提供。

甲醇，色谱纯，德国默克。其余试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。水为超纯水，18.4MΩ·cm。滤膜，0.22μm，美国安捷伦公司。

1.2仪器与设备

UPLC 1290，美国Agilent公司；6538 UHD Accurate-MS Q-TOF LC/MS，美国Agilent公司，配有G4212A紫外检测器及电喷雾离子源（Electrospray Ionization，ESI）、Agilent C18色谱柱（50mm×2.1mm，1.8μm），二极管阵列（DAD）检测器，Waters自动进样器；R-3旋转蒸发仪，瑞士步琪；Mill-Q Advantage A10超纯水仪，美国Millipore；榨汁机，美的WBL25B26。

1.3样品的制备

马家柚去皮，称取2.0kg果肉用榨汁机绞碎后加2L甲醇浸泡提取5d，提取液过滤，于旋转蒸发仪上旋干，得到7.8g马家柚甲醇提取物。称取7.0g马家柚甲醇提取物，溶解于100mL蒸馏水中，用等体积的水饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇层溶液，旋干后冷冻干燥，得到4.2g萃取物，称取0.5g萃取物溶解于10mL 50％甲醇，用0.22μm滤膜过滤，得马家柚果肉样品溶液，供UPLC-MS分析使用。

1.4UPLC-MS分离检测条件

实验采用UPLC 1290超高效液相色谱系统，DAD检测器，检测波长λ=340nm；使用Agilent UPLC1290，ZORBAX Eclipse Plus C18（RRHD）色谱柱（50mm×2.1mm，1.8μm）用于优化流动相的条件，流动相A为水（含0.1％甲酸），流动相B为100％甲醇，二元线性梯度洗脱，流动相梯度设置为0～30min，5％B～100％B，流速为0.25mL/min，柱温25℃，进样体积为2μL。

使用6538 UHD Accurate-MS Q-TOF LC/MS，ESI源负离子模式下检测，主要质谱的工作参数如下：电喷雾ESI源MS全扫描和Target MS/MS负离子模式，雾化温度为325℃。干燥气N2流速为10L/min，雾化气压为30psig，离子扫描范围为m/z50～1700。

2　结果与分析

图1A（见下页）为马家柚提取物的UPLC-MS总离子流色谱图，图1B（见下页）为340nm下的UPLC液相色谱图，两个色谱图基本一致。

实验结果表明，采用UPLC-MS色谱分离条件，马家柚提取物中的化学成分得到较好的分离。在超高效液相色谱与质谱联用实验中，马家柚果肉提取物中的化学成分在负离子谱中丰度较大，主要出现[M-H]-准分子离子峰，通过UPLC-MS负离子谱获得色谱峰1～11对应化合物的分子量，结合其它的碎片离子信号和相关文献研究报道，推测马家柚果肉化学成分的结构。柚中黄酮类成分主要有三类结构[7]，他们具有明显的紫外吸收特征。（1）黄酮-O苷，其带Ⅰ和带Ⅱ紫外吸收为325和280nm左右；（2）黄酮-C苷，其带Ⅰ和带Ⅱ紫外吸收为340nm 和270nm左右；（3）黄酮醇-O苷，其带Ⅰ和带Ⅱ紫外吸收为355nm和260nm左右。

有机酸：柑橘中含有较高的有机酸，构成其风味物质，有机酸主要有柠檬酸、奎宁酸和苹果酸等，其中柠檬酸是柑橘果实中含量最高的有机酸，是决定果实品质的重要因素之一。峰1（TR 2.38min），负离子谱中，m/z 191.0195丰度最高，为[M-H]-准分子离子峰，表明峰1分子量为192，结合其紫外吸收（λmax 205nm）为末端吸收，结构中不含有共轭双键，另外其保留时间较短，这些都与柑橘中主要的有机酸柠檬酸较为一致[8]，推测峰1可能为柠檬酸。

图1　马家柚果肉化学成分UPLC-DAD-QTOF-MS总离子流(A)和液相色谱(B)图

表1　马家柚果肉11种化学成分

黄酮-O苷：是柚类果实中含量非常丰富的一类黄酮类次生代谢产物，其紫外吸收特征明显，有两个吸收峰，包括带Ⅰ325nm和带Ⅱ280nm左右。

峰2（TR 6.996min）负离子谱中，m/z为449.1081且丰度最高，为[M-H]-准分子离子峰，表明峰2分子量为450。其紫外吸收值显示为特征黄酮类化合物的紫外吸收，碎片离子峰287.0555，表明峰2为黄酮糖苷，苷元分子量为288，根据文献报道[9]从柚中鉴定的黄酮类成分，其可能为圣草素，柚中鉴定的黄酮糖苷多为7位糖基化，峰2推测为圣草素-7-O-葡萄糖甙。

峰4（TR 11.613min），负离子谱中，m/z595.1638丰度最高，为[M-H]-准分子离子峰，表明峰4分子量为596，碎片离子峰与峰2类似，分子量比峰2大146，推测为一个鼠李糖基，根据文献报道[7]推测峰4为新圣草枸橼苷，文献报道广西蜜柚、沙田柚和常山胡柚等均含有此化合物。

峰5（TR 12.908min），负离子谱中，m/z 433.1140丰度最高，为[M-H]-准分子离子峰，表明峰5分子量为434，碎片离子峰271.0613，表明峰5为黄酮糖苷，苷元分子量为272，检索文献[7]推测其为柚皮素，因此峰5为柚皮素-7-O-葡萄糖甙。

峰6（TR 13.174min），负离子谱中，m/z 579.1729丰度最高，为[M-H]-准分子离子峰，表明峰6分子量为580，碎片离子峰与峰5类似，分子量比峰5大146，推测为一个鼠李糖基，根据文献[7]报道推测峰6为柚皮苷，另外，峰6为马家柚中的主要化学成分。

峰7（TR 16.827min），负离子谱中，m/z 609.1792丰度最高，为[M-H]-准分子离子峰，表明峰7分子量为610，碎片离子峰301.2546，与橙皮素分子量相符，推测峰7为橙皮苷或新橙皮苷，但是根据文献报道[10]柚果皮和果肉中的新橙皮苷含量远远高于橙皮苷，因此推测峰7为新橙皮苷，具体结构还有待于进一步分离，通过NMR确定其结构。

峰8（TR 17.326min），负离子谱中，m/z621.1807丰度最高，为[M-H]-准分子离子峰，表明峰8分子量为622，碎片离子峰271.0607与峰5和6类似，为柚皮素糖苷，分子量比峰6大42，可能为一乙酰基，根据文献[7]报道推测峰8为乙酰柚皮苷。

峰9（TR 18.023min），负离子谱中，m/z577.2248丰度最高，为[M-H]-准分子离子峰，表明峰9分子量为578，碎片离子峰269.3412和431.1564，表明峰9含有一个葡萄糖基和鼠李糖基，推测峰9为芹菜素-7-O-新橙皮糖苷，又名野漆树甙，曾有文献报道，其多存在于柑橘类的水果中[11]。

峰11（TR 30.312），负离子谱中，m/z271.2272丰度最高，为[M-H]-准分子离子峰，表明峰11分子量为272，峰11为峰5,6和8的苷元部分，推测峰11为柚皮素，柚皮素为柚子中含量较高的黄酮化合物[10]。

黄酮-C苷：也是一类黄酮类次生代谢产物，其紫外吸收表现为带Ⅰ340nm和带Ⅱ270nm左右。峰3(TR 11.214min)，负离子谱中，m/z 593.1468丰度最高，为[M-H]-准分子离子峰，表明峰3分子量为594，其紫外吸收显示其为黄酮C苷类化合物[7]，根据文献[7,9]，推测峰3为芹菜素-6-C-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷。

黄酮醇-O苷：柚类果实中报道的此类化合物主要为山柰酚糖苷，其紫外吸收带Ⅰ355nm和带Ⅱ260nm左右。峰10（TR 19.119min），负离子谱中，m/z577.2263丰度最高，为[M-H]-准分子离子峰，表明峰10分子量为578，峰10和9为同分异构体，但是峰10的紫外吸收显示其为黄酮醇-O苷，且为山柰酚糖苷[12]，这也与碎片离子峰285.0392（山柰酚）相符，推测峰10为山柰酚7-O-鼠李糖3-O-鼠李糖苷。

3　结论

本研究建立了UPLC-DAD-QTOF-MS法鉴定马家柚果肉中的黄酮类成分。UPLC-QTOF-MS具有分析时间短、效率高、灵敏度高、需要样品量少等诸多优点，现已广泛应用于中草药等植物次生代谢产物的分离鉴定[13-15]。通过对柚果肉和果皮化学成分研究的文献报道进行检索，了解柚中的化学成分种类，根据各化合物的结构特点、分子量、液相色谱、保留时间和质谱裂解规律，黄酮类化合物在负离子模式下可以得到[M-H]-准分子离子峰，以及黄酮母核的碎片离子峰信号等信息，对11种化合物进行解析，推测为（1）柠檬酸、（2）圣草素-7-O-葡萄糖甙、（3）芹菜素-6-C-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷、（4）新圣草枸橼苷、（5）柚皮素-7-O-葡萄糖苷、（6）柚皮苷、（7）新橙皮苷、（8）乙酰柚皮苷、（9）野漆树甙、（10）山柰酚7-O-鼠李糖3-O-鼠李糖苷和（11）柚皮素。其中柚皮苷为马家柚中主要的黄酮苷类成分。

参考文献：

[1]张为.江西国家地理标志保护产品广丰马家柚[J].质量探索,2012,9(7):15.

[2]朱岳麟,郑晓梅,邹卓,等.GC-MS法分析红肉蜜柚果皮香精油的化学成分[J].广东化工,2008,35(9):129-131.

[3]陈静,高彦祥,吴伟莉,等.高效液相色谱法测定柑橘汁中的柠檬苦素和柚皮苷[J].色谱,2006,24(2):157-160.

[4]毛祥青,叶为波,施身兵,等.广丰马家柚优质栽培技术[J].江西农业学报,2010,22(2):77-80.

[5]吴方方,杨海建,曹立新,等.授粉对广丰马家柚果实品质的影响[J].中国南方果树,2012,41(3):76-77.

[6]王齐发,黄昌新,叶正旺.广丰马家柚采收与保鲜贮藏[J].现代园艺,2015,36(1):33.

[7]Zhang M,Duan C,Zang Y,et al.The flavonoid composition of flavedo and juice from the pummelo cultivar(Citrus grandis(L.) Osbeck)and the grapefruit cultivar(Citrus paradisi)from China[J]. Food Chemistry,2011,129(4):1530-1536.

[8]陈青英,陈俊伟,徐红霞,等.大棚栽培‘玉环柚’果实发育与糖酸积累特性[J].福建农业学报,2015,30(5):492-497.

[9]Tripoli E,La Guardia M,Giammanco S,et al.Citrus flavonoids: Molecular structure,biological activity and nutritional properties:A review[J].Food Chemistry,2007,104(2):466-479.

[10]方波,赵其阳,席万鹏,等.十种柚类及柚杂种果实中类黄酮含量的超高效液相色谱分析[J].中国农业科学,2013,46(9): 1892-1902.

[11]张元梅,周志钦,孙玉敬,等.高效液相色谱法同时测定柑橘果实中18种类黄酮的含量[J].中国农业科学,2012,45(17): 3558-3565.

[12]Wan C,Yu Y,Zhou S,et al.Isolation and identification of phenoliccompoundsfromGynuradivaricataleaves[J]. PharmacognosyMagazine,2011,7(26):101-108.

[13]练杭芸,梁乾德,马增春,等.UPLC-QTOF-MS比较当归和川芎煎液化学成分差异[J].解放军药学学报,2015,31(1):4-9.

[14]张亚中.基于超高效液相-四级杆-飞行时间串联质谱的白花蛇舌草注射液主成分分析[J].中草药,2013,44(7):829-833.

UPLC-QTOF-MS Analysis of Constituents in the Pulp of Citrus maxima (Burm.)Merr.cv.Majia Yu

Wan Chun-peng1ZHOUYou-yong2CHENJin-yin1
(1.Jiangxi KeyLaboratoryfor Postharvest Technologyand Nondestructive Testing of Fruits&Vegetables,College of Agronomy, Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China;2.Jiangxi Pomelo Color Fantasy of Agricultural Science and TechnologyDevelopment Company,Shangrao334606,China)

Abstract:Chemical Constituents in the pulp of C.maxima(Burm.)Merr.cv.Majia Yu were analyzed by UPLC-DADQTOF-MS method.Agilent C18（50mm×2.1mm,1.8μm）chromatographic column and the 6538 UHD Accurate-MS Q-TOF LC/MS spectrometer were used to analysis the extract sample,the other parameters of UPLC were as follows:methanol and water(containing 0.1％formic acid)gradient elution,detection wavelength was 340nm,the flow rate was 0.25mL/min, column temperature was 25℃.The ESI-MS anion quasi molecular ion peaks,product ions,the retention time,ultraviolet chromatogram were used to tentative identify the chemical constituents.Eleven chemical compositions were identified as (1)Citric acid,(2)Eriodictyol-7-O-glucoside,(3)Apigenin-6-C-glucose-7-O-glucoside,(4)Neoeriocitrin,(5)Naringenin-7-O-glucoside,(6)Naringin,(7)Neohesperidin,(8)Acetyl naringin,(9)Rhoifolin,(10)Kaempferol-7-O-rhamnose-3-O-rhamnoside and(11)Naringenin.Naringin was the main flavonoid glycosides in the pulp of C.maxima(Burm.)Merr.cv. Majia Yu.

Key words:Citrus maxima(Burm.)Merr.cv.Majia Yu;chemical Constituents;UPLC-QTOF-MS

作者简介：万春鹏（1983—），男，博士，助理研究员，主要从事天然植物化学研究

基金项目：江西省教育厅科技落地计划项目（111）；江西省“赣鄱英才555工程”（2012）

收稿日期：2015-10-08

中图分类号：R284.1

文献标志码：A

文章编号：1008-1038(2016)02-0028-04