苹果渣中苹果多酚柱层析分离工艺研究

葛邦国　宋　烨

（中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东济南250014）



苹果渣中苹果多酚柱层析分离工艺研究

葛邦国宋烨

（中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东济南250014）

摘要：本文研究了大孔吸附树脂对苹果渣中苹果多酚纯化和Sephadex凝胶对苹果多酚的精制工艺参数，选定AB-8为纯化用大孔吸附树脂，采用70％乙醇作为解吸剂；Sephadex凝胶精制后的苹果多酚，经冷冻干燥，得到苹果多酚粉末。苹果多酚得率为0.12％，苹果多酚的纯度由初步纯化的15.5％提高到75.6％。

关键词：苹果多酚；大孔树脂；纯化；精制

植物多酚的提取纯化工艺，一般采用乙醇提取，真空浓缩，然后树脂吸附进行初步纯化，但这种方法能耗高，过程长，产品纯度不高[1,2]。随着功能成分提取技术的发展，多酚的提取纯化更多的采用柱层析技术，使用大孔吸附树脂和Sephadex凝胶，以提高产品纯度[3,4]。近年来，大孔吸附树脂在植物功能性成分提取纯化中的研究和应用日渐增多，显示出了独特的吸附和洗脱特性，这一技术既可提高样品供试液纯度，也可减少有毒有机溶剂的使用[5-7]。Sephadex凝胶属于分子筛凝胶，具有分子筛特性，可按分子量大小分离物质，适合于不同类型有机物的分离，性质稳定，易实施循环操作。本文研究了大孔吸附树脂对苹果渣中苹果多酚纯化和Sephadex凝胶对苹果多酚的精制工艺参数。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

实验所用材料为经微波法或超临界二氧化碳提取得到的苹果多酚粗提物。大孔吸附树脂X-5、AB-8、NKA9、HD400，购于天津南开大学化工厂；Folin-Ciocalteu试剂，购于Sigma公司；绿原酸、(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素、p-香豆酸、槲皮素，咖啡酸、香草醛、阿魏酸、根皮苷、没食子酸等物质，均购自于Sigma公司；其它试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

岛津UVmini-1240紫外/可见分光光度计（日本）；RE1002旋转蒸发仪，常州市国立试验设备研究所（中国）；2BV循环水式多用真空泵，北京融合立盛科技有限公司（中国）；HZX-HA型水浴恒温振荡器，金坛市精达仪器制造有限公司（中国）；LC2200S分析天平（德国）；TDL-5-A高速离心机，上海安亭仪器厂（中国）；层析柱（1.6cm×40cm)），无锡兆阳化工装备有限公司（中国）。

1.3苹果多酚的测定

选择Folin酚法测定苹果多酚。酚类物质的含量采用高效液相色谱测定，标样为绿原酸、(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素、p-香豆酸、槲皮素，咖啡酸、香草醛、阿魏酸、根皮苷、没食子酸。色谱分析条件：Kromasil C18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈（A）和水（B）；柱温30℃；进样量10μL；流速1.0mL/min。紫外检测器检测，波长280nm。

表1　梯度洗脱条件

1.4大孔吸附树脂的预处理[8]

选取的四种大孔吸附树脂分别用95％乙醇室温浸泡24h后，装柱，首先用95％乙醇洗涤，至流出溶液加水不呈白色混浊，再用蒸馏水脱除乙醇。接着用2BV的5％ HCl淋洗并浸泡4h，水洗至中性；再用2BV的2％NaOH溶液淋洗并浸泡4h，水洗至中性。

1.5Sephadex G25预处理

SephadexG25在使用之前将凝胶溶胀于层析溶剂中至少3h。先用2～3个柱体积的洗脱液进行清洗。凝胶柱的填装在保证胶粒不变形的前提下，应在尽可能高的压力下装柱。将处理好的凝胶在烧杯内用1倍体积的洗脱液搅拌成悬浮液，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱。

1.6测定指标及方法

树脂的吸附量（mg/g）及解吸率（％）计算公式如下：

2　结果与分析

2.1大孔吸附树脂静态吸附解吸试验

2.1.1大孔树脂的筛选

准确称取已处理好的AB-8、X-5、HD400、NKA四种树脂各2.0g于150mL三角瓶中，分别加入40mL 0.866mg/mL苹果多酚提取液，置于水浴恒温振荡器上，40℃、150r/min振荡，在1、2、3、4、5h设定时间取样测定，以吸附量、时间作图。

由图1可知，HD400、NKA和X-5起始吸附能力较差，随着时间的延长，吸附量缓慢上升；AB-8起始吸附量较大，此后吸附量增加较快，在4～5h内即可基本达到平衡。从图中可看出，AB-8对苹果多酚的吸附量和吸附速率都高于X-5、HD400和NKA。所以最终选定AB-8为纯化用大孔吸附树脂。

图1　不同树脂对苹果多酚的吸附效果

2.1.2不同浓度乙醇对解吸效果的影响

对于苹果多酚的解吸，从解吸能力、易于回收、节能、廉价和毒性角度来选择适宜的解吸剂，综合考虑，以醇类较佳。本研究选用乙醇作为解吸剂，通过静态实验来确定乙醇浓度。取充分吸附苹果多酚后的AB-8树脂1.0g，分别准确加入30％、50％、70％、80％、90％乙醇各25mL，室温静置24h，过滤，检测滤液中苹果多酚的含量，根据滤液中多酚含量计算乙醇解吸能力，比较乙醇浓度对苹果多酚解吸效果的影响，结果见表2。由表2可以看出，随着乙醇浓度的增加，树脂的吸附能力越大，当乙醇浓度大于70％时，树脂吸附能力增幅不是很大，同时乙醇浓度越大，乙醇越容易蒸发，有安全隐患，因此本实验选用70％乙醇作为解吸剂，此时解吸率为85.68％。

表2　不同乙醇浓度对苹果多酚的解析效果

2.1.3温度对吸附性能的影响

准确称取经预处理的AB-8树脂5.0g，置于150mL三角瓶中，加入浓度为0.866mg/mL的苹果渣提取液50mL，静置4h，吸附温度分别设定为20℃、30℃、40℃和50℃，结果见图2。由图2可以看出，温度对吸附性能的影响很小，温度30℃时吸附能力只比20℃提高5％，考虑到节能，故在室温下进行吸附即可。

图2　温度对吸附效果的影响

2.2AB-8大孔吸附树脂动态纯化苹果多酚工艺

称取2.0g预处理好的AB-8树脂，装入2.0×40cm的玻璃层析柱中。将0.866mg/mL浓度的样品放入树脂，分段收集样品，当流出液浓度达上样的1/5时，可认为苹果多酚已收集结束，停止进样，计算吸附量。

2.2.1粗提液浓度对树脂吸附能力的影响

粗提的苹果多酚，添加不同质量的蒸馏水，进行动态树脂吸附实验。若粗提液浓度小于0.5mg/mL，试验过程中，树脂容易泄漏，部分树脂未能完成吸收，从而影响树脂的吸附能力；浓度大于1.5mg/mL，溶液出现絮状沉淀，使树脂堵塞，吸附能力下降。由图3可以看出，当浓度在1.1mg/mL时，树脂的吸附能力最大。故上样浓度控制在1.0mg/mL～1.3mg/mL范围内。

图3　上样浓度对吸附量的影响

2.2.2吸附流速对吸附能力的影响

研究不同吸附流速对树脂吸附能力的影响，选择流量分别为1、2、3、4BV/h，试验结果见图4。由图4可知，在1BV/h～4BV/h内，随着流速的增加，每毫升树脂对苹果多酚的吸附能力下降，但2BV/h较3BV/h、4BV/h下降速度慢，综合考虑，本试验选择流速为2BV/h。

图4　流速对吸附量的影响

2.2.3粗提液pH对树脂吸附能力的影响

将粗提液用10％HCl和10％NaOH调节成不同pH值的溶液，进行动态吸附实验，结果见图5。由于多酚呈弱酸性，所以要达到较好的效果必须在弱酸性条件下进行吸附。当粗提液pH=4.80时，AB-8树脂对苹果多酚的吸附能力最强。在较高的pH（pH>4.80）条件下，酚羟基由于解吸而增加了其在水中的溶解度，从而降低了树脂在水溶液中对多酚的吸附能力。而当pH<4.80时，部分黄酮类物质改变性质，树脂吸附能力下降。因此，pH为4.80时，树脂吸附能力较强。

图5　pH对解吸效果的影响

2.2.4不同解吸速度对洗脱效果的影响

图6　苹果多酚解析曲线

选择浓度为1.1mg/mL的粗提液，采用2BV/h的流速进行吸附，以5BV去离子水洗涤，然后用70％乙醇进行洗脱，解析流速采用1BV/h、2BV/h，分时段测定洗脱液中多酚的含量，制定解吸效果的曲线，结果见图6。

解吸流速大小影响解吸效果，流速过快，解吸拖尾严重，洗脱带宽，洗脱不彻底，效果差；流速过慢，解吸时间长，苹果多酚易损失。常用的解吸流速是吸附流速的1/3～1/2，由图6可以看出，不同流速对解吸能力是有一定的影响，以1BV/h的流速进行洗脱得到的峰形集中，2BV/h的流速洗脱则略有拖尾现象，故采用1BV/h的解吸流速，即为吸附流速的1/2，实验结果表明解吸效果较为理想。经过计算所得的苹果多酚制品的纯度由纯化前的6.8％提高到15.5％。

2.3苹果多酚的精制

经大孔吸附树脂纯化后的样品仍含有较多糖类。采用SephadexG25可以对苹果多酚进行进一步精制。SephadexG25属于分子筛凝胶，具有分子筛特性，可按分子量大小分离物质，适合于不同类型有机物的分离，并且性质稳定，易实施循环操作。

样液上柱后用蒸馏水洗脱，流速1mL/min，每8min收集一次洗脱液，1～10为水洗液，10管后采用80％的乙醇以0.5mL/min的流速进行洗脱，每管按照0.5mL/min的量收集洗脱液，然后逐管分别进行多酚的测定，结果如图7所示。从图7可以看到，比较明显的峰有6个，其中最早出现的峰多酚含量较少，自25管之后多酚的含量明显增加，25～50管之间为多酚分布的高峰区间，合并25管之后的洗脱液进行组成测定。

图7　SesphedexG25精制苹果多酚的结果

2.4苹果多酚的组成研究

将10种标准品，绿原酸、儿茶素、表儿茶素、没食子酸、根皮苷、槲皮素、阿魏酸、对香豆酸、咖啡酸各取少量，用甲醇溶解后，混合稀释至合适的浓度，按1.7中所述的色谱条件，以保留时间为横坐标，吸光度为纵坐标，做图，标准品图谱结果见图8。

在苹果渣中共检测出5种多酚物质，分别是绿原酸、表儿茶素、儿茶素、对香豆酸和根皮苷，见图9（1、表儿茶素，2、绿原酸，3、儿茶素，4、对香豆酸，5、根皮苷）。从苹果多酚物质组成及比例上看，绿原酸含量最高，约占多酚物质的85％，其它如儿茶素、对香豆酸、根皮苷等含量较低。精制后的苹果多酚，经冷冻干燥，得到产品苹果多酚粉末。经过计算所得苹果多酚得率为0.12％，苹果多酚的含量由初步纯化的15.5％提高到75.6％。

图8　标准品图谱

图9　苹果多酚图谱

3　结论

本研究选用AB-8大孔吸附树脂进行苹果多酚的柱层析纯化，采用2BV/h吸附流速，1BV/h的解吸流速，可将苹果多酚较好的洗脱下来。大孔树脂纯化后的苹果多酚经Sephadex精制得到纯度较高的多酚产品。此时，苹果多酚总酚得率为0.12％，含量为75.60％。

参考文献：

[1]石碧,狄莹.植物多酚[M].北京:科学出版社,2000:8-21.

[2]任静.苹果多酚类物质的提取分离及活性研究[D].西安:西北大学,2005.

[3]黄文强.吸附分离材料[M].北京:化学工业出版社,2005.

[4]姜慧,籍保平,李博,等.影响苹果多酚分离提纯的因素[J].食品科学,2004,(25):6.

[5]郭娟.苹果渣中苹果多酚的提取、纯化及功效研究[D].郑州:河南农业大学,2006.

[6]戚向阳,陈维军,杨尔宁.苹果多酚提取物的组成及其抗氧化性能的研究[J].中国粮油学报,2003,18(5):70-72.

[7]钱庭宝.吸附树脂及其应用[M].北京:化学工业出版社,1900, (10):433-436.

[8]袁怀波,赵国华.利用大孔吸附树脂纯化葛根异黄酮的研究[J].食品与发酵工业,2003,29(2):62-65.

The Research of Column Chromatography Separation of Apple Polyphenols in Apple Rvesidue

GE Bang-guo SONGYe
(Jinan Fruit Research Institute All China Federation ofSupply&MarketingCo-operatives,Jinan 250014,China)

Abstract:Research the purification of apple polyphenols from apple residue by macroporous adsorption resin,sephadex purification process parameters of apple polyphenols,select AB-8 for purification with macroporous adsorption resin,use 70％ethanol as a desorption agent.Apple polyphenols after purification by Sephadex,after freeze drying,get apple polyphenol powder,yield is 0.12％,content increased from 15.5％to 75.6％。

Key words:Apple polyphenols;macroporous resin;purification;refined

作者简介：葛邦国（1978—），男，硕士，高级工程师，研究方向为果蔬精深加工

基金项目：国家农业科技成果转化资金项目（2010GB24420688）

收稿日期：2015-09-01

中图分类号：TS255.3

文献标志码：A

文章编号：1008-1038(2016)02-0020-05