植酸酶体外水解植物性饲料原料工艺条件的研究

■吴丰惟祝爱侠刘　翼卜小丽韩朋伟王春维，2

（1.武汉轻工大学动物科学与营养工程学院，湖北武汉430023；2.武汉市畜禽饲料工程技术中心，湖北武汉430023）



植酸酶体外水解植物性饲料原料工艺条件的研究

■吴丰惟1祝爱侠1刘翼1卜小丽1韩朋伟1王春维1，2

（1.武汉轻工大学动物科学与营养工程学院，湖北武汉430023；2.武汉市畜禽饲料工程技术中心，湖北武汉430023）

摘要：为解决直接添加植酸酶到水产饲料中不利于植酸酶充分发挥作用的问题。试验参考吉富罗非鱼饲料配方，以豆粕、棉粕和菜粕为原料，按比例为15∶9∶7混合，采用植酸酶进行体外水解，在单因素试验的基础上，以水解效率为指标，采用正交试验研究加酶量（A）、反应温度（B）、加水量（C）和酶解时间（D）4个不同因素对植酸酶体外水解植物性饲料原料效率的影响。结果表明，各因素对植酸酶体外水解植物性饲料原料效率的影响程度依次是A＞B＞C＞D。其最佳酶解工艺条件为：加酶量为2 000 U/kg底物，反应温度35℃，加水量50%，酶解时间为3 h。在此条件下得出的植酸酶水解效率为42.16%。

关键词：植酸酶；体外水解；单因素试验；正交设计；水解效率

磷是构成动物体的常量元素之一，是动物骨骼、甲壳、鳞片和牙齿的主要构成成分，也是参与体内能量代谢、蛋白质合成等许多生命活动过程的重要元素[1]。饲料中的磷是畜禽及水产动物摄取磷的主要来源，饲料中磷缺乏或VD3不足都会影响动物对磷的吸收与利用，当磷缺乏达到一定程度时，水产动物就会出现生长速度下降、饲料效率降低和骨骼微量元素含量下降等症状[2]。而植物性饲料中的磷大部分以植酸的形式存在，不易被鱼体所吸收，继而直接排入养殖水体中，大量排放还会引起水体的富营养化，导致藻类的大量繁殖和水体缺氧，给水产养殖的可持续发展带来巨大威胁。

植酸是一类普遍存在于大多数植物性饲料中的抗营养物质。植酸能和某些蛋白质形成难溶性的复合物[3]，阻碍蛋白质的消化与吸收。植酸盐还会使动物体内蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等消化酶的活性降低，致使动物体对蛋白质、碳水化合物、脂肪等营养物质消化率降低[4]。由于单胃和无胃动物体内缺乏能分解植酸磷的酶，无法将植酸磷分解为可利用的无机磷，因此很难利用以植酸盐的形式存在的磷[5-8]。必须在植酸酶的作用下才能被分解成可利用的无机磷。

现有的饲料加工技术都是将植酸酶直接加入到全价配合饲料粉状原料中（包括：植物性、动物性、维生素、矿物质等多种原料，含有植酸的原料约占总原料的40%），再经过一系列加工，如制粒、膨化、高温调制、熟化制粒的加工过程，而植酸酶的耐热性有限，造成其失活、有效性降低。另外被大家忽视的是植酸酶最适的pH值条件，植酸酶最佳酶解的pH值为5.5；因此现有的直接添加技术，被动物采食后其胃（畜禽pH值为1.5～2.5，水产动物肠道为中性）和畜禽肠道（pH值为7.0～7.5）环境均不利于植酸酶充分发挥功效，造成植酸酶的效率进一步降低。

1材料与方法

1.1试验原料与试剂

豆粕、棉粕、菜粕购于武汉九星饲料有限公司；植酸酶(粉状，2 500 U/g，最适pH值5.5)市购。

表1植物性原料基本营养成分(%)

1.2主要仪器与设备

TAS-990火焰型原子吸收分光光度计；超恒温水浴锅；隔水式恒温培养箱；离心机；868型pH值计；电热式恒温干燥箱；分析天平等。

1.3试验方法

1.3.1酶处理方法

参照Cain等的酶处理方法[9]，将粉状植酸酶溶解到乙酸/乙酸钠缓冲溶液中(约0.25 mol/l，调节pH值至5.5)，常温下持续搅拌30 min，制成均匀酶液。

分别称取150 g豆粕、90 g棉粕和70 g菜粕充分混合，作为底物。按照试验条件需要定量称取植酸酶，加入定量体积的乙酸/乙酸钠缓冲溶液(0.25 mol/l，pH值5.5)中，于磁力搅拌器上常温搅拌30 min，制成均匀酶液后，倒入底物中，常温下混合10 min，装入密封袋中，密封；放入恒温培养箱并设定温度。酶解后将其取出，取样并将样品置于电热式恒温干燥箱中烘8 h至绝干，分别测定酶解前后底物样品中的植酸含量，计算酶效率。

1.3.2测定方法

①水分和干物质测定：依据国标方法，植物性原料在105℃下烘干测定水分及干物质含量(GB5497-85)。

②总蛋白质含量的测定：采用改良凯氏定氮法(GB5505-85)。

③总磷的测定：钒钼酸铵分光光度法[10]。

④植酸的测定：参照Miller等1980年提出的植酸测定方法[11]，有所改进。

样品处理：将样品粉碎混匀后置于电热式恒温干燥箱中烘8 h至绝干。

a)植酸的提取：称取约1 g样品于50 ml塑料离心管内，加30 ml 4%三氯乙酸室温下震荡提取2 h，静置4～6 h。其后4 000 r/min离心10 min，取上清液，残余沉淀用10 ml 4%三氯乙酸冲洗4 000 r/min离心10 min，取上清液合计约40 ml转入另一个50 ml离心管。

b) Fe-phytate沉淀：向(a)中所得约40 ml上清液中加入2 ml FeCl3溶液(Fe3+浓度为4 μg/ml)，l00℃水浴加热45 min，形成白色絮状的Fe-phytate沉淀，冷却后于4 000 r/min离心10 min弃去上清液；加入40 ml左右的蒸馏水洗去吸附的FeCl3，4 000 r/min离心10 min弃去上清液。

c) Fe-phytate沉淀的溶解：将(b)中所得沉淀物转入离心管，向离心管中加入10 ml 1.5 M NaOH以溶解Fe-phytate沉淀，不断震荡，形成Fe(OH)3沉淀，4 000 r/min离心10 min弃上清液。用3.3 M HNO3溶解，形成Fe(NO3)3溶液，定容至50 ml容量瓶。

d) Fe含量的测定：用原子吸收分光光度法测定。

植酸含量的计算公式：

PA(μM)=Fe(μM)/4.2(4.2为Fe-phytate沉淀中铁与植酸的摩尔比)

PA(μg)=PA(μM)×660(660为植酸分子量)

酶效率的计算公式

有效磷含量(μg)=总磷含量(μg)-植酸磷含量(μg)

酶效率（%）=100%-(处理后植酸磷含量/处理前植酸磷含量)×100%

1.3.3植酸酶最佳酶解条件的确定

首先采用单因素试验设计，以植酸酶酶解效率为指标，对影响植酸酶体外酶解的主要因素（加水量、酶解温度、加酶量和酶解时间）进行单因素分析，确定酶解参数的适宜范围。然后根据数据分析结果，设计4因素3水平正交试验L9（34），最终确定植酸酶体外酶解的最佳参数。

2结果与讨论

2.1加水量对植酸酶体外酶解植酸的效率的影响

取5份底物，每份310 g，加酶量为1 000 U/kg底物，加水量分别为20%、30%、40%、50%、60%。将混合好的酶液分别倒入底物中，混合10 min后分别装入封口袋中，放入恒温培养箱中30℃下酶解5 h，测其植酸磷含量，计算植酸酶体外酶解植酸的效率，结果（如图1）所示。

图1加水量对植酸酶体外酶解植酸效率的影响

图1可以看出，随着底物中加水量的增加，底物中被分解的植酸逐渐增多，酶效率逐渐升高，当加水量达到50%后，随着加水量的增加，酶效率的增长趋于平坦，说明向底物中加入50%的水已经基本满足植酸酶体外酶解所需的水环境。在植酸酶预处理植物性饲料原料的过程中，若物料中水含量过低，由于缺乏媒介，植酸酶很难接触到物料中的植酸，致使植酸酶的作用效果不佳；但随着加水量的增加，物料中水含量不断升高，越来越充足的水为植酸酶对植酸的催化分解反应提供了一个良好的水环境，植酸酶的酶解效率也随之升高；但是当加水量增大到一定程度时，植酸酶反应过程所需的水环境已具备，此时水环境不再是影响植酸酶发挥作用的主要因素，再增加加水量，植酸酶的酶效率也不会大幅增加，甚至当加水量过高时，植酸酶酶液中植酸酶的浓度可能会因被过度稀释而降低酶解效率，综合考虑选择50%加水量进行下一步试验。

2.2温度对植酸酶体外酶解植酸的效率的影响

取5份底物，每份310 g，加酶量为1 000 U/kg底物，加水量为50%，将混合好的酶液分别倒入底物中，混合10 min后分别装入封口袋中，然后放入恒温培养箱中，分别将温度设定为25、30、35、40℃和45℃，酶解5 h，测其植酸磷含量，计算植酸酶体外酶解植酸的效率，结果(如图2)所示。

图2可看出，随着温度升高，植酸酶酶解效率先呈上升趋势，当温度超过35℃时，又呈下降趋势，这说明植酸酶酶解有其最适宜的温度范围，过高或过低的酶解温度环境都会阻碍植酸酶作用效果。原因在于植酸酶是一种蛋白质，在温度较低时，植酸酶的酶活会随着温度的升高而升高，反应速度也随之逐渐加快，但是当温度达到植酸酶的耐受上限之后，继续升高温度会导致植酸酶逐渐变性而失去活力，酶效率也不再增加，还有可能会降低。刘大川[12]的研究证实酶解反应的温度应当在一定范围内进行上下波动，而且产物的含量变化也不是很大。本试验中酶解温度为35℃时，植酸酶的酶解效率达到最大值30.92%；继续升高温度，植酸酶酶解效率反而呈下降趋势。因此，在适宜的范围内，升高温度有助于酶解反应的进行，但是一般的植酸酶在温度超过35℃时，都会因不能耐受而逐渐失去活性。因此选取35℃为以后试验的酶解温度。

图2温度对植酸酶体外酶解植酸的效率的影响

2.3加酶量对植酸酶体外酶解植酸的效率的影响

取5份底物，每份310 g，分别调节加酶量为500、1 000、1 500、2 000、2 500 U/kg底物，加水量为50%，将混合好的酶液分别倒入底物中，混合10min后分别装入封口袋中，然后放入恒温培养箱中35℃下酶解5 h，测其植酸磷含量，计算植酸酶体外酶解植酸的效率，结果如图3所示。

试验中应用微生物植酸酶在体外对植物性饲料原料中的植酸进行水解，随着植酸酶加量的不断增大，植酸酶的酶解效率的增加幅度逐渐减小。图3可看出，底物中植酸的量固定时，增加加酶量，植酸酶的效率也随之增加，底物中被分解的植酸的量增加，但酶效率的增加幅度逐渐减小，并趋于平坦，当加酶量为2 500 U/kg底物时，酶效率最高，为40.27%。底物中植酸的量是不变的，当加酶量不断增大时，植酸酶的浓度升高，越来越多的植酸被水解为肌醇和磷酸盐，但随着植酸酶浓度的不断升高时，酶与底物的结合部位逐渐达到饱和，酶促反应速度增加的幅度不断下降，当酶浓度过饱和时，酶量的增加不再增加酶效率。考虑到植酸酶的价格问题，选取植酸酶的加酶量为2 000 U/kg底物进行下一步试验，此加酶量下的酶解效率为39.08%。

图3加酶量对植酸酶体外酶解植酸效率的影响

2.4酶解时间对植酸酶体外酶解植酸的效率的影响

取5份底物，每份310 g，加酶量为2 000 U/kg底物，加水量为50%，将混合好的酶液分别倒入底物中，混合10 min后分别装入封口袋中，然后放入恒温培养箱中35℃下分别酶解1、2、3、4 h和5 h，测其植酸磷含量，计算植酸酶体外酶解植酸的效率，结果(如图4)所示。

图4酶解时间对植酸酶体外酶解植酸的效率的影响

图4可以看出，植酸酶体外水解植物性饲料原料时，植酸酶的酶解效率随酶解时间的延长而增加，但随着酶解时间的延长，酶解效率的增加量逐渐迟缓，3 h后酶效率已达到最大值41.94%，再继续延长酶解时间，酶解效率没有明显变化，主要的原因可能是在酶解前期植酸酶的活力比较高，产物抑制比较小，当酶解时间不断延长，植酸酶的作用位点已经大部分断裂，植酸酶的酶活力下降，其对植酸的水解反应渐渐停止。综合考虑酶解效率和经济效益，选择3 h作为下一步试验的酶解时间。

以植酸酶水解效率为参考指标，通过单因素试验分析得出植酸酶体外水解植物性饲料原料的适宜条件为：加水量50%、温度35℃、加酶量2 000 U/kg底物、酶解时间3 h。在此条件下，酶效率达到41.94%。

2.5植酸酶体外水解植物性饲料原料的正交试验结果分析

在单因素试验基础上，为了进一步研究不同因素对植酸酶体外水解植物性饲料原料效率的综合影响，试验对加酶量、反应温度、加水量和酶解时间进行4因素3水平的正交试验L9（34），以植酸酶酶解效率为考察指标，确定植酸酶体外水解植物性饲料原料的最佳工艺参数。正交试验因素水平表和正交试验结果及分析如表2和表3所示。

表2植酸酶体外酶解条件正交试验因素水平

由表3得知，根据极差R大小，影响指标的因素主次顺序为：A＞B＞C＞D，即加酶量＞酶解温度＞加水量＞酶解时间。最佳酶解工艺条件组合为A3B2C3D1，但由单因素试验可知，当加水量为50%和60%时效果几乎一样，从酶解成本方面来考虑，选用组合A3B2C2D1，即加酶量为2 000 U/kg底物，酶解温度35℃，加水量50%，酶解时间为3 h。

由极差分析图可知，凡是连成的直线越陡，则说明其波动越大，即对指标的影响程度越大，是主要因素。由图5可以看出，因素A对植酸酶的酶解效率的直线波动最大，这也同样说明了影响植酸酶的酶解效率的主要因素是加酶量。

由于正交试验中无最佳组合试验，在此条件下做进一步的验证试验，测得植酸酶的酶解效率达42.16%，这也表明了正交试验分析的正确性。

3　结论

本试验采用单因素试验和正交试验研究不同因素对植酸酶体外水解植物性饲料原料效率的影响，得出影响指标的因素主次顺序为：A＞B＞C＞D，即加酶量＞酶解温度＞加水量＞酶解时间，最佳酶解工艺条件为A3B2C2D1，即加酶量为2 000 U/kg底物，酶解温度35℃，加水量50%，酶解时间为3 h。在此条件下得出的植酸酶水解效率为42.16%。

表3正交试验结果及分析

图5极差分析

参考文献

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（编辑：崔成德，cuichengde88@sina.com）

Study on the technology of enzymatic hydrolysis of plant feed ingredients in vitro

Wu Fengwei, Zhu Aixia, Li Yi, Bu Xiaoli, Han Pengwei, Wang Chunwei

Abstract：The study is to solve the problem that directly adding phytase into aquaculture feed cannot exert the action of phytase sufficiently. This experiment referenced the GIFT feed formulation ratio of 15∶9∶7 which is mixed of soybean meal, cottonseed meal and rapeseed meal, using hydrolysis in vi⁃tro of phytase, consider the hydrolysis efficiency as an indicator, apply orthogonal test based on singlefactor test to research with 4 influential factors addition of enzyme amount (A), the reaction tempera⁃ture (B), addition of water (C) and enzymatic reaction time (D). The optimal sequence was A＞B＞D＞D. The optimal parameters of hydrolysis by phytase of plant raw materials in vitro, the result as follows: addition of enzyme 2 000 U per kilogram of substrate, the reaction temperature 35℃, addition of wa⁃ter 50%, enzymatic reaction time 3 h. Under these conditions enzymatic efficiency comes to 42.19%.

Key words：phytase；hydrolysis in vitro；Single factor experiment；Orthogonal design；efficiency of hy⁃drolysis

收稿日期：2015-11-09

通讯作者：祝爱侠，讲师。

作者简介：吴丰惟，硕士，主要从事饲料添加剂及资源开发的研究。

中图分类号：S816.5

文献标识码：A

文章编号：1001-991X（2016）03-0049-05

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.03.010