小麦氮素高效育种研究进展

徐 晴，许甫超，董 静，秦丹丹，李梅芳

(湖北省农业科学院粮食作物研究所，湖北武汉 430064)



小麦氮素高效育种研究进展

徐 晴，许甫超，董 静，秦丹丹，李梅芳

(湖北省农业科学院粮食作物研究所，湖北武汉 430064)

摘要：氮素是植物生长的必需元素，也是粮食作物产量的一个重要限制因素。培育氮素高效利用的农作物新品种不仅可以降低农业生产成本，还可以从根本上解决氮素施用不当造成的各种问题，是新一代绿色高效农业的发展方向。本文综述了当前小麦氮素高效利用育种研究进展，包括小麦氮素利用效率的评价、小麦氮素响应的基因型差异、影响小麦氮素利用率的形态及理化性状、小麦氮素利用相关基因的挖掘及分子育种与传统育种相结合提高氮素利用率等。

关键词：小麦；氮素利用效率；种质资源

氮素是植物生长的必需元素之一，它调控植株生长发育的多个进程。研究表明，作物叶片中75%的还原氮以Rubisco酶的形式参与植株的光合作用[1]。同时，它也是植物体内蛋白质、氨基酸、细胞膜分子复合物及激素、维他命等分子的组成成分，对植物体的生长发育起着至关重要的作用[2]。

在农田中，作物所需氮素主要来自于有机肥料的分解和土壤对氮素的固定。自20世纪60年代第一次绿色革命倡导无机化肥对作物生长的促进作用以后，合成肥料尤其是氮肥被大量推广应用，不仅促进了粮食的大幅增产，也解决了人们的温饱问题[3]。由于显著的增产作用，在过去的几十年中，氮肥消耗量在我国农业生产资料投入中保持着持续增长的趋势[4]。目前，我国已经成为世界上氮肥生产和消费量最大的国家[5]。然而，过量施用氮肥造成各种问题正日益凸显。首先，其对作物的增产作用正逐渐降低，1980至2005年间我国氮肥利用效率下降了近24%[4]。其次，我国氮肥施用已经进入过剩状态，利用率下降，造成资源浪费。数据显示，至2000年，我国氮肥的施用量已经超过200 kg·hm-2，远高于印度(100 kg·hm-2)和发达国家(120 kg·hm-2)[6]。由于氮肥的当季利用率仅有30%～40%，多余的氮肥以淋溶、反硝化、挥发等方式流失，并增加环境污染的风险[7]。同时，氮肥施用量的不断增加也直接导致了农业生产成本的增高，给农民和农业生产造成了巨大的经济压力。

小麦是我国仅次于水稻的第二大粮食作物，其耕种面积占全国粮食作物耕种面积的26%，仅2006年小麦的产量就达到了1.04亿吨，占全国总粮食产量的20.7%和世界小麦产量的16%[8]。在以产量为第一性状的育种模式下，我国目前主推小麦品种均需要中高以上肥水条件，氮肥利用水平低，氮素高效利用品种匮乏。虽然育种家都已经意识到目前小麦育种中由于品种氮素利用效率不高及氮肥过量施用所造成的各种问题，但由于小麦氮素性状控制复杂、氮素利用效率评价指标不一、氮素吸收利用机理研究不够透彻等问题，极大地阻碍了小麦氮高效品种的选育[9]。因此，本文对小麦氮素吸收利用的基因型差异、高氮效小麦种质筛选与评价、与小麦氮素吸收利用相关的生理形态指标、小麦氮素利用相关基因位点的挖掘和克隆等方面的研究进展进行了综述，以期为氮高效小麦品种的选育提供帮助。

1小麦氮素利用效率的基因型差异

作物氮素利用具有较大的基因型差异。研究发现，在低氮素供应条件下，作物产量的基因型差异主要是由氮素的吸收效率决定；而在高氮素供应条件下，作物产量则由氮素的吸收效率和利用效率共同决定[14]。根据不同基因型小麦在不同氮素水平的响应情况，可以将小麦划分为不同类型。王永华等，依据氮素利用效率(NUE)将20个基因型小麦分为双高效型(在低氮和高氮条件下均有较高的NUE)、低氮高效型(只在低氮条件下具有较高的NUE)、双低效型(在高氮和低氮条件下均不能获得较高的NUE)和高氮高效型(仅在高氮条件下具有较高的NUE)。但需要指出，不同基因型小麦氮素利用对不同肥力水平的氮素利用表现也不一致，不能单纯地以作物在某一养分浓度时的生物产量或籽粒产量对氮素利用效率进行分类，而应该采取对氮素的响应度进行分类[15]。例如，有的基因型在低氮条件下能获得较高的产量，但增施氮肥时，产量增加并不显著，属于低氮耐受型；而有的基因型虽然在低氮条件下产量受限，但一旦增施氮肥，产量能大幅提高，属于氮素敏感型；有的基因型无论高氮或低氮条件均能反应迅速，并获得较高的产量。这些不同的氮反应类型可能与作物本身不同的氮素吸收、代谢、转运机制有关。在大麦、油菜等作物的相关研究中也得到相似的结果[16-17]。因此，利用氮素吸收的基因型差异筛选氮素利用效率高的种质，进而培育出氮素高效的品种已经成为育种家的共识[11]。同时，要注意慎重选择田间筛选条件，充分了解不同种质在不同环境中的特性，为育种提供帮助。

2小麦氮素高效利用种质的评价

除了通过施肥方式、土壤管理、灌溉等田间栽培措施提高氮素利用效率外，广泛开展不同时期、不同地区的小麦种质资源的收集和评价工作，筛选氮素高效吸收、转运和积累的种质材料，对新品种选育具有重要意义[10]。

如何对氮素利用效率进行定义是种质评价首先要解决的问题。一般来讲,作物氮素利用效率(NUE:Nitrogen Use Efficiency)是指土壤中单位氮素(Ns:包括土壤中残留氮素和新施入氮素)所能产生的籽粒产量(Gw)，即NUE=Gw/Ns。它可以被分为两个部分即氮素吸收效率(NupE=Nt/Ns，反映植株从土壤中吸收氮素所能形成的地上部生物学产量的能力，Nt为地上部吸收的氮量)和氮素籽粒生产效率(NutE=Gw/Nt，反映植株吸收氮素转化成籽粒产量的能力[12])。

另外，氮素收获指数(NHI，nitrogen harvest index)、地上部氮素积累量(AGN，above-ground N uptake)、籽粒氮素浓度(GNC，grain nitrogen concentration)、根长密度(RLD，Root length density)、绿面积指数(GAI，Green area index)、叶片氮素含量(SLN，Specific leaf nitrogen content)、光饱和条件下CO2交换率(Amax，light-saturated CO2exchange rate)、氮素再分配效率(NRE:Nitrogen remobilization efficiency)等也常作为氮素利用效率的一些常用评价指标[13]。不同指标的具体计算公式见表1[13]。

3影响小麦氮素利用效率的形态及理化性状

小麦对氮素的吸收利用是一个动态的变化过程，包括氮素的吸收、同化、利用、分配、再循环、再分配、再利用等。在不同生长阶段，影响小麦氮素吸收利用的因素不同。

3.1小麦根系性状对氮素利用效率的影响

开花前的营养生长阶段是小麦氮素吸收和同化的主要阶段。此时，负责氮素吸收的根系性状是影响氮素吸收的关键因子。小麦根通常有六条种根和10～15条冠状根系组成，根系最长可达140～200 cm(冬小麦)或80～120 cm(春小麦)[18]。由于小麦根系田间生长的复杂性、取样困难等问题，根系性状与氮素利用之间的相关性评价一直是一个棘手的问题[19]。目前根系相关研究中通常采用“Rhizoponics”或者水培系统进行[20-21]。汪晓丽等采用水培的方法研究不同浓度氮素对小麦根系的影响，发现低浓度氮可以促进根系生长，但是高浓度(>2 mmol·L-1)氮抑制根系生长[22]。王平等研究指出，氮素利用效率高的小麦品种在根干重、根长、侧根数目方面均高于低氮效的品种[23]。在利用Minirhizophon系统对田间氮肥施用与小麦根系生长的相关性研究发现，氮肥可以促进小麦根系的生长[24]。Barraclough等曾提出根长密度(RLD，root length density)的概念，即单位体积土壤中的根系长度，来反映作物对土壤中养分吸收的能力。开花期小麦20 cm浅土层的RLD通常为5.6～10 cm·cm-3，而80～100 cm土层RLD为0.4～1.5 cm·cm-3[25]。另有研究表明，小麦氮素吸收的临界RLD值为1 cm·cm-3(获得最大氮素吸收的最小根长密度)[18]。不少报道指出小麦根长密度存在基因型差异，但是其与氮素利用的关系的研究还鲜见报道，因此能否利用RLD作为氮素利用效率评价性状还有待研究。Steele等在水稻根系研究中，通过与根长相关的四个QTL的分子标记轮回选择创制了一个水稻的近等基因系，其在产量和生物量上均超过了轮回亲本[26]。因此，也可以利用与根系性状相关的QTL对小麦氮高效材料进行分子标记辅助筛选。

3.2小麦氮素的转运、还原与同化对氮素利用效率的影响

氮素被根系吸收后，由氮素转运蛋白(ammonium transporters)负责将其跨膜转运至植物体内，氮素能否高效转运也是决定氮素利用效率的因素。研究发现，植物体内硝酸盐存在低亲和、高亲和两套转运系统[46]。除了基因 AtNRT1.1在两个转运系统都发挥作用外，其余的52个 NRT1基因家族成员均属于低亲和转运系统成员，负责高浓度(>1 mmol·L-1)氮素环境的硝酸盐转运。它们主要表达在根系皮层( AtNRT1.2)、近木质部根中柱鞘质膜( AtNRT1.5)、叶柄( AtNRT1.4)、果夹液泡( AtNRT1.6)等部位。高亲和转运系统主要负责低浓度( 1 μmol·L-1～1 mmol·L-1) 氮素环境的硝酸盐转运，由 NRT2基因家族成员负责[27]。目前，拟南芥中发现有7个 NRT2家族基因，而这些基因也主要在根系和茎中表达，这与他们负责氮素的吸收和转运一致[2]。虽然硝酸盐是小麦的主要氮素吸收形式，但是铵盐常作为硝酸盐之外的植物氮素补充形式。研究发现植物对铵盐的吸收主要由AMT转运蛋白家族成员负责。

氮素被吸收后经一系列酶促反应将其还原并同化成可供植物利用的氨基酸。首先，氮素在硝酸还原酶(NR)的作用下在细胞质中被还原成亚硝酸。亚硝酸盐进而被转运到质体或者叶绿体中，在亚硝酸还原酶(NiR)的作用下被还原成铵态氮。然后在质体和叶绿体中，铵态氮在谷氨酰胺合成酶(GS)/谷氨酸合成酶(GOGAT)的作用下被转化成谷氨酰胺和谷氨酸。合成的氨基酸主要参与植物体内酶和蛋白的合成，进而参与植株光合及形态建成[28]。因此，与该过程相关的每一环节都有可能成为影响作物生长、产量及氮素利用效率的限制因素。虽然NR被认为是氮素还原的关键酶，但是多个通过改变NR基因表达的研究结果显示，并不能对植物生长造成明显改变，这可能与基因功能的冗余性或者转录后的调控相关[29-30]。最近，Vanita等依据硝酸还原酶活性对几百份小麦材料进行筛选，选出了高硝酸还原酶活性(HNR)和低硝酸还原酶活性(LNR)小麦种质，其中HNR基因型小麦在氮素收获量、植株生物产量上均高于LNR基因型小麦，说明较高的硝酸还原酶活性是氮素高效利用的标志之一[31]。

作为氮素同化的关键酶，GS活性的提高能大大促进铵离子向氨基酸的合成转化和氮素向籽粒的转运，进而提高作物产量，这在很多报道中均得到了证实。Habash (2001) 通过基因工程手段增加了GS基因在小麦旗叶中的表达后，转基因植株在根系数量、产量和籽粒氮含量均获得显著提升[32]。而在水稻中，突变其中的一个GS基因后，植株的生长和籽粒产量均受到显著影响[33]。这些研究表明，虽然GS蛋白有不同的异构体，但是单个基因的改变就对植株体产生了较大的影响，说明GS在植株氮素同化和产量形成中起着至关重要的作用，也从另一个方面表明通过对GS活性的调控有可能会改变作物的氮素利用效率，进而促进作物增产的。

3.3小麦花后氮素再分配对氮素利用率的影响

进入灌浆期，小麦植株根系吸收能力逐渐下降，形成籽粒产量所需氮素主要来自营养器官积累的氮素向籽粒的再转运[34]。小麦籽粒中60%～95%的氮来源于开花前茎叶和根系中储存的氮素的再转运[10]。研究表明，小麦营养器官氮素转运效率的遗传变异度为0.52～0.92，变异度受环境、施氮水平的影响较大[25]。但是，对影响氮素向籽粒转运的调控机制尚不清楚。目前主要观点认为籽粒氮含量受单位土地面积籽粒产量和蛋白合成能力所决定的籽粒氮需求调控或者是受营养器官的氮供应调控，或者由两者共同调控，即主动与被动的籽粒氮需求所调控。无论是哪种调控方式，高氮素利用效率的小麦种质都应该具有较高的籽粒氮素转运效率。

3.4小麦滞绿性与氮素利用效率的关系

滞绿性(stay-green)是指跟普通基因型相比，一个品种在灌浆期能够保持更久绿色叶面积的能力[35]。叶片衰老性状对氮素利用有十分重要的作用。在养分充足供应条件下，小麦植株一般衰老缓慢，但是在养分供给受限的情况下，叶片衰老趋于加快，通常会影响籽粒的灌浆。因此，小麦植株叶片在灌浆期保持绿色，可以延缓衰老，进而延长植株光合时间，给地上部生长提供更多养分，同时输送养分到根系，促进根系对氮素的吸收，最终保证植株体能够形成最大的干物质生产量。已有研究表明，功能性滞绿与叶绿素和叶绿素结合蛋白的降解相关，降低该类蛋白的降解可以提高作物产量[36]。Spano 等发现具有滞绿性的硬粒小麦突变体在粒重和最终籽粒产量方面均优于对照株系[37]。但也有研究表明，植株的滞绿性通常会导致N素从叶片向籽粒转运减缓，导致贪青晚熟。总的来说，植株滞绿性可以延长营养的供给，增加源库比，从而提高作物产量和NUE，但是又要注意它与氮素转运的关系，在种质筛选中，要选择性的平衡二者的关系。

4与小麦氮素利用相关的基因功能发掘

在模式植物拟南芥中，氮素吸收利用的机理研究已经较为透彻，与氮素利用效率相关的基因研究报道较多，而作为多倍体植物，小麦遗传组成相对复杂，该方面的研究尚处在初级阶段。目前的研究主要集中在与氮素相关的QTLs位点的发掘及少量相关基因的功能研究上。Quarrie等利用含有96个单株的小麦DH系构建了包含567个分子标记的高密度遗传连锁图谱[26]。Habash利用该图谱将21个与植株性状、产量、叶片氮素同化等相关的性状进行了定位，最终发现了126个相关基因位点，其中一个与GS 活性相关的QTL被共定位在2A染色体的 GS2基因上，而另一个QTL位点则与GSr基因共定位与4A染色体上。同时，还发现了13个与籽粒氮含量相关的QTL位点分别位于染色体2AS、 4AS、5BS、5DL 和7A端粒的位置，而与叶耳氮含量相关的QTL则被定位于染色体6上[38]。在利用另一个群体构建的图谱中，Fontaine 主要研究了与氮素利用效率及产量紧密相关的谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脱氢酶(GDH)在染色体上的分布，发现了分别分布于13条染色体的26个与GDH相关和25个与GS相关的QTL位点，其中仅一个与GS相关的QTL位点与位于染色体4B上的GSe基因重合，一个与GDH相关的QTL位点与一个位于染色体2B上编码GDH基因的位点重合[39]。值得注意的是，这些定位研究均涉及到氮素同化途径中的GS。氮素利用相关酶的发现一方面证实了他们研究结果的有效性，另一方面也说明GS在植物氮素利用中的重要作用。为此，Bernard对小麦中的所有GS基因进行了挖掘和序列比对分析，共发现10个GS基因，并将其聚类分为四个亚家族( GS2、GS1、GSr和GSe)。免疫定位分析将这些基因分别定位在薄壁细胞、韧皮部及中柱鞘细胞上[40]。除了GS基因，氮素代谢GS/GOGAT循环途径中的谷氨酸合成酶基因GOGAT也在近期被克隆和鉴定[41-43]。这些研究结果为鉴定和发现氮素利用途径中的新基因和位点提供了可能，基因的克隆也有助于利用分子标记辅助选择氮高效的小麦种质。作为小麦氮素的主要吸收蛋白，包含16个成员的NPF基因家族也被鉴定出来，迥异的组织特异性及空间特异性表达模式说明不只是在模式植物，小麦中可能存在着更为复杂的氮素吸收调控途径，以帮助植物适应不同的环境条件[44]。

5传统育种和分子育种相结合对小麦氮素高效利用品种进行遗传改良

虽然传统育种方式已经在改良提高小麦新品种的氮素利用效率上取得了较大进展，但是运用生物技术手段对小麦品种进行改良能够加快育种进程，是现代农业发展的方向。通过分子育种方式对作物氮素利用性状进行改良需要在不同氮素水平下鉴定出影响该性状的主要基因，或者确定影响该性状的主要位点，然后创制分子标记辅助育种。

目前，研究上主要有三种途径可以加快对氮素利用效率相关基因的揭示。第一种是通过杂交构建遗传连锁图谱，对于氮素吸收利用相关的农艺、生理生化性状进行QTL定位。第二种是通过转录组学的研究，鉴定出对氮素能迅速响应的基因，并进行定位。这些可能是氮素吸收和代谢途径上的主要基因，或者是与控制氮素利用效率相关的性状的基因。第三种是通过基因工程的手段，将与氮素高效相关基因导入目标作物载体。例如，C4植物通常拥有比C3植物更高的氮素利用效率，这与C4植物在CO2固定方面特殊的结构和代谢特点相关。Matsuoka等曾将玉米中的一个C4光合基因引入水稻，使其光合效率得到显著的提高[45]。因此，通过基因工程手段对农作物进行改良也是未来农业的一个发展方向。

总体来说，除了提高栽培技术，田间管理措施外，培育氮高效的新品种是提高小麦氮素利用效率的重要途径。小麦在进化过程中，为适应不同的环境条件常发生自然突变而形成变异新种质。这些新种质蕴含了大量的优异遗传基因。因此，扩大种质资源的搜集范围，设定不同氮素水平，采用不同条件下的筛选指标对小麦种质进行定向筛选，可以为育种提供较好的亲本材料，加快营养高效型小麦新品种的培育。另外，还要尽快建立氮素高效利用表观性状或者生理性状与氮素利用效率的相关性体系，使育种家能够简单快速地对品种或者种质的氮素利用情况进行判断，加快育种进程。同时，通过对氮素吸收同化机制的研究，掌握该过程中影响氮素吸收利用和产量形成的关键因子，如氮素代谢途径中关键节点的基因等，通过基因工程或者分子标记辅助选择的方式对这些关键因子进行调控，进而实现小麦氮素利用效率的提高。最新的研究报道中，小麦的基因组信息已经部分释放[47]，小麦研究正逐步跨入功能基因组及大数据分析的时代，借助基因组、转录组分析等手段，挖掘与氮素高效利用相关的基因也将为小麦育种研究提供新的发展契机。

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Research Advances on Nitrogen Use Efficiency (NUE) in Wheat (TritiumaestivumL.) Breeding

XU Qing,XU Fuchao,DONG Jing,QIN Dandan,LI Meifang

(Institute of Food Crops,Hubei Academy of Agriculture Sciences,Wuhan,Hubei 430064,China)

Abstract:Nitrogen is not only an essential macronutrient required for plant growth but also a major limiting factor in determining crop yield. The increases of yield due to the application of nitrogen fertilizers has being considered as the success of modern agriculture in the last decades. However,the over-use of chemical fertilizers like nitrogen has resulted in numerous environmental problems such as water and soil nitrogen pollutions. These concerns raised prompt the breeding scientist to breed new wheat varieties with enhanced nitrogen use efficiency (NUE) to reduce the amount of fertilizers application and the agricultural cost to farmers. In addition,it is also the way to the development of green and sustainable agriculture. Here,we reviewed the research advances in wheat nitrogen use efficiency,including the assessment of nitrogen use efficiency,the genotypic differences for NUE,the morphological and chemi-physiological traits affecting the NUE,the molecular cloning of NUE-related genes,and the combination of traditional and molecular breeding. It is expected that this review will provide assistance to the breeding scientist in wheat NUE research field.

Key words:Wheat; Nitrogen use efficiency (NUE); Germplasm

中图分类号：S512.1；S330

文献标识码：A

文章编号：1009-1041(2016)01-0044-07

通讯作者：李梅芳(E-mail:limeifang100@126.com)

基金项目：湖北省农业科技创新中心项目(2007-620-001-03)；湖北省科技支撑计划(公益性科技研究)项目(2013BBB07)

收稿日期：2015-07-27修回日期：2015-08-25

网络出版时间：2016-01-08

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160108.1821.012.html

第一作者E-mail：xuqinghbaas@163.com