一株H1N1亚型猪流感病毒的分离与鉴定及部分生物学特性的研究

黄燕玲

（广西南宁雷克斯商贸有限公司，广西南宁 530001）

一株H1N1亚型猪流感病毒的分离与鉴定及部分生物学特性的研究

黄燕玲

（广西南宁雷克斯商贸有限公司，广西南宁 530001）

本研究从广西某规模化猪场临床病猪肺脏组织中分离到一株猪流感病毒，并对该毒株进行了亚型鉴定和部分生物学特性的研究。结果显示分离到的猪流感病毒为H1N1亚型，HA效价最高达到27。对该毒株分别进行耐热性实验、耐酸性实验、乙醚和氯仿敏感性试验，发现该毒株对热不稳定，并对酸、乙醚和氯仿均敏感，说明该毒株对自然的抵抗力较差。

猪流感病毒；分离鉴定；生物学特性

猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）属于正粘病毒科，可引起猪的急性传染性群发性的猪呼吸道疾病-猪流感（swine influenza，SI）。猪流感病毒的首次记载可以追溯到1918年在人群中广泛流行的西班牙大流感，在西班牙流感流行期间，美国中北部猪群中也出现类似于人流感的流感样症状，并且有研究显示为H1N1亚型流感病毒引起[1-3]，但当时未分离到猪流感病毒。直到1931年，Shope分离到第一株猪流感病毒A/Swine/Iowa/15/31（H1N11）[4]。目前，猪流感在世界范围内呈广泛性流行，遍及欧洲、美洲、亚洲、非洲等世界各地。在猪群中广泛流行的亚型主要是H1N1、H1N2和H3N2，其中又包含基因来源不同的基因型：古典猪H1N1、类人H1N1、类禽H1N1、类人H3N2、基因重配H3N2和多基因型的H1N2[5，6]。猪流感一年四季均可发生，不同日龄、品种和性别的猪均可感染，猪群发病率达100%，死亡率低，无并发感染的病例能够自然康复。猪流感是规模化猪场普遍存在并且难以根除的疾病之一，其群发性发生的特点导致患病猪只的生产性能下降，直接影响了猪群的健康状态，对养猪业的危害极大。更值得重视的是，猪流感在猪群中的发生，往往会引起其他继发性感染，如巴氏杆菌病、猪呼吸与繁殖障碍综合症、胸膜肺炎放线杆菌病等等，这是由于猪流感病毒对呼吸道上皮具有高度特异性亲和性而使呼吸道管壁上皮受到损伤而导致的继发感染。由此，继发感染或混合感染导致猪群死亡率增高，经济损失更是无法估量[7]。

2014年12月底，笔者从广西某猪场的一例临床病死保育猪的肺脏中分离到一株H1N1亚型的猪流感病毒，并对其部分理化特性进行研究。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2014年12月，广西某猪场一例临床病死保育猪肺脏。发病猪为保育猪（10～15kg），病死前表现为发烧、咳嗽和流鼻涕等症状。

1.2 鸡胚及试剂

9～11日龄SPF鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。M-MLV酶、Rnasin、dNTPs和Ex-Taq DNA Polymerase mix购自Takara公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit 购自北京全式金生物技术有限公司。

猪流感病毒RNA的反转录引物为Uni12：5'--AGC AAA AGC AGG--3'；猪流感病毒的鉴定检测采用针对病毒M基因的RT-PCR检测，引物序列参照文献[8]；分离株的HA基因和NA基因进行亚型鉴定采用RT-PCR的方法并参考文献[9，10]的引物，引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.4 病毒分离

将肺脏研磨后，用PBS溶液1：5稀释混成匀浆，将匀浆吸入到EP管中，离心取上清，加入10 000IU的青、链霉素，放置4℃4h后，尿囊腔接种9～11日龄鸡胚，0.2ml/胚，每份样品接种4个胚，35℃孵育72h～96h，弃去接种后24h内死亡鸡胚，收获尿囊液，对尿囊液测定HA效价和RT-PCR检测。

1.5 分离株RT-PCR鉴定

1.5.1 RNA的提取 取本分离株尿囊液300 ☒l，加入700☒l Trizol Reagent RNA提取液，混匀，室温放置10 min后，加入300 ☒l的氯仿溶液，混匀后室温静置5 min，将该混合溶液12000 rpm 离心10 min，取600 ☒l上层溶液放置到新的1.5 ml的EP管，加入等量的异丙醇，混合均匀后放置到-20℃ 冰箱沉淀 10 min，12000 rpm离心10 min，弃上清，加入75%的乙醇溶液后7500 rpm 离心5 min，弃掉乙醇溶液，倒置EP管放入50℃ 温箱干燥，干燥后加入25 ☒l 的DEPC水溶解RNA。

1.5.2 RT-PCR检测 按照Takara公司的M-MLV反转录酶试剂盒25☒l逆转录反应体系：5×M-MLV buffer 5 ☒l，dNTP（10mmol/ L）2 ☒l，Uni12 1 ☒l，M-MLV 0.5 ☒l，Rnasin 0.5 ☒l，16 ☒l RNA，将反应体系置于42℃ PCR仪中 60 min 反转录成cDNA。按照Takara 公司试剂盒的操作说明配制PCR反应体系：Ex-Taq DNA Polymerase mix 12.5 ☒l，上、下特异性引物（25☒mol/L）各1 ☒l，cDNA 2 ☒l，加灭菌水补足25 ☒l。检测SIV的反应条件为95℃ 预变性3 min，95℃变性30 s、50℃ 30 s、72℃ 1 min，35个循环，最后72℃ 延伸10 min；鉴定HA和NA亚型的反应条件为95℃预变性3 min，95℃变性30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min，35个循环，最后72℃ 延伸10 min。取PCR产物5 ☒l，在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，在紫外灯下观察结果。

1.5.3 测序 将PCR产物进行电泳后，按照上海生物工程有限公司胶回收试剂盒说明书进行产物回收，将胶回收产物送上海生物工程有限公司进行测序。

1.6 分离株部分理化特性的研究

本研究采用探索性因子分析方法来验证结构效度。首先需要对数据进行KMO样本测量和Bartlett球体检测来判断问卷是否适合做因子分析。一般KMO值在0.8以上，Bartlett球形检验的显著水平(Sig.)<0.05表明可以做因子分析，本研究问卷的KMO 测量值>0.8，同时Bartlett球体检测的显著性概率<0.05，因此适合做因子分析。KMO和Bartlett的检验结果见表3。

1.6.1 耐热性实验 取分离株鸡胚尿囊液，分为5组，每组1 ml，分别置于 4℃作用60 min，50℃作用15、30和60 min及60℃作用10 min，每个处理的样品分别接种3枚鸡胚，35℃培养，收集24～96 h死亡或未死鸡胚液，测定HA效价。

1.6.2 乙醚敏感试验 取分离株鸡胚尿囊液1 ml，加入0.25ml乙醚，4℃作用24h，同时用灭菌生理盐水代替乙醚作对照，每个处理样品分别接种3枚鸡胚，35℃培养，收集24～96h死亡或未死鸡胚液，测定HA效价。

1.6.3 氯仿敏感试验 取分离株鸡胚尿囊液，分为2组，每组1 ml，一组加入终浓度为48 ml/L的氯仿，4 ℃作用10 min；另一组用灭菌生理盐水代替氯仿作对照，每个处理样品分别接种3枚鸡胚，37 ℃培养，收集24～96h死亡或未死鸡胚液，测定HA效价。

1.6.4 耐酸性试验 取含SIV鸡胚尿囊液，等量分装为2份，一份用0.1 mol/L盐酸调至pH3.0，室温下作用3 h，再用56g/L碳酸氢钠（NaHCO3）溶液将 pH值调至7.0；另一份加入灭菌生理盐水，同样室温下放置1 h，尿囊液经10倍稀释后，每个处理样品分别接种3枚鸡胚，35℃培养，收集24～96 h死亡或未死鸡胚液，测定HA效价。

2 结果

2.1 病毒分离和初步鉴定

将病猪肺脏的组织匀浆接种SPF鸡胚盲传三代，收集第三代的鸡胚尿囊液，测定HA效价，发现尿囊液对鸡红细胞悬液具有凝集现象，血凝价（HA）达到27。提取鸡胚尿囊液RNA，应用RTPCR检测SIV为阳性。进行RT-PCR HA和NA亚型鉴定，扩增出HA亚型的目的片段大小为442bp，NA亚型片段大小为668bp（图1）并且其扩增产物测序结果证实分离株的HA基因和NA基因分别为H1亚型和N1亚型，根据鉴定结果，该毒株为H1N1亚型猪流感病毒，对该毒株进行命名为A/swine/Guangxi/1/2014。

图1 猪流感分离株RT-PCR亚型鉴定的结果

2.2 分离株热稳定性测定、乙醚敏感试验、氯仿敏感试验及耐酸性试验结果

对A/swine/Guangxi/1/2014（H1N1）进行耐热性实验，结果见表1，结果表明分离株为热不稳定型。将A/swine/Guangxi/1/2014（H1N1）新鲜尿囊液应用乙醚、氯仿和酸处理后，接种鸡胚，收集96h后的鸡胚尿囊液，测定HA效价，均无效价，说明分离株对乙醚、氯仿和酸敏感。

表1 A/swine/Guangxi/1/2014（H1N1）耐热性实验结果

3 讨论

目前，在世界范围内猪群中发现的SIV包括H1N1、H1N2、H3N2、H1N7、H4N6、H9N2、H5N1、H3N8和H3N6等9种亚型，其中在猪群中主要的流行亚型为H1N1、H1N2和H3N2 3种[11]。单纯性的猪流感并不会引起猪的死亡，因此其死亡率极低，但由于猪可作为禽流感病毒和人流感病毒基因重组的“混合器”，并且经过基因重组后的新毒株可能具有感染人类的能力即其在“禽-猪-人”的流感病毒跨种屏障中具有重要的公共卫生学意义，因此SI一直受到人们广泛关注。自1997年至今，我国各地不断地在进行SI的血清学调查，结果显示各地猪群中均存在SIV的感染[12]。1999～2001年的SI血清学调查结果显示，我国猪群中主要存在的是H1亚型和H3亚型SIV的感染；2002～2003年的血清学调查结果则显示了猪群中开始出现H9亚型和H5亚型SIV的感染，并在同一时间内分离到了H9N2和H5N1亚型SIV[13]。

对于广西地区而言，2005～2006年，梁家幸等对广西地区2 156份猪血清进行H1和H3亚型抗体进行检测，H1亚型抗体阳性率为29.04%，H3亚型抗体阳性率为31.54%[14]；高永锐等于2006年对广西1 000份猪血清进行了H3N2抗体的检测，发现其抗体平均阳性率为25.7%[15]；2006～2007年间，黄胜斌等对2 500份血清进行H1、H3、H5和H9亚型抗体进行检测，H1亚型平均抗体阳性率为58.73%，H3亚型平均抗体阳性率为49.13%，而H5和H9亚型均呈阴性[16]。至2004年至今，在GenBank上记录的广西SIV的分离株有95株，其中H1N1亚型有32株，H1N2亚型有29株，H3N2亚型有23株，H9N2亚型有8株和3株H5N1，这些数据对于我区乃至中国的猪流感防治和监测具有重要的指导意义。

猪流感病毒的血凝特性易受到温度的影响，本分离株对热具有不稳定性且对酸敏感，说明该毒株对自然的抵抗力较差，但对于其传播能力、致病性、分离株的各个基因片段来源和遗传进化规律还有待进一步研究。

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黄燕玲（1985—），女，广西桂林人，大学学历，从事临床兽医和养殖。