二维色谱分析技术及其在烟草行业中的应用

荆磊磊，刘春波，张凤梅，吴亿勤，刘志华，张安丰，杨光宇，申钦鹏*，缪明明

(1.云南中烟工业有限责任公司 技术中心/云南省烟草化学重点实验室，云南 昆明 650231；2.昆明理工大学 化学工程学院，云南 昆明 650500)

二维色谱分析技术及其在烟草行业中的应用

荆磊磊1,2，刘春波1，张凤梅1，吴亿勤1，刘志华1，张安丰1,2，杨光宇1，申钦鹏1*，缪明明1

(1.云南中烟工业有限责任公司 技术中心/云南省烟草化学重点实验室，云南 昆明 650231；2.昆明理工大学 化学工程学院，云南 昆明 650500)

摘要：二维色谱峰容量高，且有着强劲的分离与分辨能力，使得二维色谱在分析复杂组分时极具优势。概述了3种不同的二维色谱分析技术(气相-气相二维色谱、液相-液相二维色谱、液相-气相二维色谱)的原理以及其他相关内容，分类介绍了每种二维色谱，并简述了二维色谱在烟草行业中的应用，最后对二维色谱的发展趋势及其在烟草行业中的应用做了展望。

关键词：二维色谱；气相色谱；液相色谱；复杂组分；烟草行业

近年来，像石化产品、卷烟烟气、环境样品以及沉积物等复杂化合物的痕量组分分析变得越来越重要，传统气相色谱由于受到峰容量和分辨率的限制，不能从这些复杂化合物中分离出所有组分。利用二维色谱联用技术，在第一维分离后进入第二维进一步分离，极大地提高了峰容量和灵敏度，为分离分析复杂样品提供了强有力的技术支持。二维色谱分析技术自诞生以来，因以其灵敏度高、分辨率高、峰容量大等特点而得到了广泛应用。本文简述了3种不同组合方式的二维色谱分析技术，综述了它们在烟草行业应用的最新进展，展望了二维色谱的发展方向及其在烟草行业中的应用。

1二维色谱

二维色谱是通过切换装置将两根分离机理不同的色谱柱串联在一起，以发挥远高于一维色谱分离能力的色谱装置，二维色谱按不同组合方式分为气相-气相二维色谱、液相-液相二维色谱和液相-气相二维色谱3种类型。

1.1气相-气相二维色谱

1951年气相色谱(GC)技术被用于分离科学，毛细管柱的开发是它第一次在分离领域取得的巨大变革，近年来高灵敏选择性的检测器使用使得它兼具分析灵敏度高和应用范围广等优点，使其成为物理、化学分析中不可或缺的重要工具。第二次变革是多维气相色谱的引入，它能分离传统一维色谱(1DGC)无法分离的复杂样品[1]。二维气相色谱分为中心切割式二维气相色谱(Heart Cutting Two-Dimensional Gas Chromatography，GC+GC)和全二维气相色谱(Comprehensive Two-Dimensional Gas Chromatography，GC×GC)。

1.1.1中心切割二维气相色谱中心切割二维气相色谱从第一维中洗脱出来的馏分仅有很少一部分被转移到柱2中进一步分离且第二维分析速度一般较慢，虽然可通过增加中心切割次数来实现对目标分析物的分离，但从柱1流出的组分进到柱2时，其谱带已经较宽，造成第二维分辨率损失[2-3]。GC+GC没有完全利用二维气相色谱的峰容量，系统总的峰容量仅为两支色谱柱峰容量之和，一般适用于所需切割成分较少的情况。

1.1.2全二维气相色谱全二维气相色谱不同于GC+GC，它是把不同分离机理且各自独立的两支色谱柱用调制器串联起来，试样从进样口导入色谱柱1(一般选用较长或液膜较厚的非极性柱)后，各化合物按沸点不同进行第一维分离，所有第一维分离后的馏分经调制器的捕集和再传送作用，以脉冲方式送到色谱柱2(一般选择较短或者液膜较薄的极性柱或中等极性柱)进行进一步的分离，色谱柱1中因沸点相近而未能得到很好分离的化合物再根据极性的不同进行第二维分离，得到的响应信号进入检测器检测，经数据采集软件处理后，得到一个以信号强度为纵坐标，柱1和柱2的保留时间为第一和第二横坐标的立体三维色谱图[4-6]。由图中各色谱峰的位置和峰体积得到各组分的定性和定量信息。GC×GC通过使用两种不同的固定相和线性程序升温消除两维分离的相关性,使系统达到真正的正交分离，样品组分在二维上的保留时间是相互独立的，峰容量为两支色谱柱峰容量的乘积，远高于GC+GC，这对于分离复杂样品和检测基体中痕量物质极为有效[7-9]。

GC×GC较之于GC+GC和1DGC具有灵敏度高、分析时间短、分辨率高、峰容量大、定量和定性分析更准确、可以实现族分离、工作效率高等优点。

1.2液相-液相二维色谱

二维色谱技术一开始是应用在气相和薄层色谱中来满足小分子量、多组分样品的分离需求，被引入到液相色谱还是在20世纪70年代[10]。理论上2DLC的峰容量是一维(1D)与二维(2D)色谱分离峰容量的乘积，远高于1DLC获得的峰容量，虽然实际分离过程中峰容量的结果会受限于2DLC的正交程度及分离过程中两维的实际分离效率，但优化后的2DLC方法通过两个不同分离过程或机理对相同样品进行分离，可以降低色谱峰的重叠，显著改善分离效果，且一个组分可以获得两个保留时间(1D和2D)，因而色谱峰确认的可靠性增加[11]。二维液相色谱根据馏分从第一维到第二维的不同转移方式可分为离线模式(off-line)和在线模式(on-line)[12]。

1.2.1离线二维液相色谱离线模式是依次收集第一维的馏分，根据需要进行浓缩等处理后进入第二维进行后续分离，每一维分离条件可独立优化。离线模式由于操作简单已被广泛应用于蛋白质组学和聚合物分析等领域，但其第一维馏分在转移过程中容易出现污染、损失、重复性差等缺点[13]，如果样品组分不稳定，还会在2DLC分离前发生变化，影响分离效果。近年来，随着样品富集浓缩技术和自动馏分收集器的发展，在很大程度上改善和提高了离线模式的应用效果。

1.2.2在线二维液相色谱在线模式是将第一维馏分中感兴趣的馏分直接切入第二维进行分离，利用特殊的接口交替收集第一维的馏分，按一定的频率进入第二维分离。较之于离线模式，在线模式具有自动化程度高、分析速度快、重复性好等优点，是目前复杂体系分离手段中发展最快和最受关注的技术。但在线模式存在着仪器复杂、两维之间需要特殊接口等缺点，还要考虑两维溶剂之间的兼容性、第二维的最大进样量以及分离速度等因素。在线二维液相色谱分为中心切割二维液相色谱(LC+LC)和全二维液相色谱(LC×LC)[12]，这两种模式中两维之间都是通过一个合适的调制器相连，主要不同之处是柱1流出物转移到柱2的量，LC+LC只是将第一维馏分中感兴趣的部分切入第二维进行再分离，为了能准确地转移组分，需要在第一维分离中使用标准物进行试验来确定切割时间。LC+LC是解决单维分离中色谱峰重叠的一种较好的方法，但它不能获得样品的全部信息，不适合分离分析未知样品。LC×LC是将第一维的馏分全部切入第二维进行分离分析，极适合复杂样品和未知组分的分析[10,14]。自从1978年LC×LC的出现，它就凭着峰容量高和强劲的分离、分辨能力被广泛应用于分离生物分子、聚合物以及其它复杂混合物[11,15]。和GC×GC相比，LC×LC相关应用的文献少有报道，但LC×LC可通过调整流动相的组成来提高分辨率，相比于GC×GC有着更大的灵活性[16]。

1.3液相-气相二维色谱

GC具有高分离能力和高分析速度，是分离复杂样品、鉴定未知化合物的有力工具，但GC的进样量小，族分离能力较差，很难用于多族组成的复杂样品及样品中痕量组分的分析；LC总柱效比GC低，难于分离复杂异构体，但能提供很好的族分离，可以对样品做净化、富集等处理。液相-气相二维色谱(LC-GC)融合LC的高样品容量、宽范围的分离机理和GC的高效分离效率，能达到对分析物样品有效清理和族分离，可以满足处理干净样品的高选择性和灵敏度要求以及复杂样品处理，同时消除了大气中氧气和水分的负面影响，相比于单独使用两者拥有更低的检测限[17-18]，TOF-MS的使用更进一步揭示了样品成分[19]。LC-GC已被广泛应用于离线模式，离线模式虽然操作简单，但是耗时、操作密集、再现性差。在线LC-GC比离线更方便、可靠，在线分析速度快、全自动、更灵敏(因为从LC上洗脱下来的全部馏分都转移到GC)以及更高的可再现性和可信度，样品处理涉及的丢失、污染等大大减少，而且使用溶剂量更少。LC-GC优于GC×GC的主要方面是它能够处理很脏的样品基质，液体样品可以不经前处理直接进样，而固体样品只需对基质进行提取以释放被提取物就可进样[18]。尽管LC-GC有着这么多优势，但仍没有被广泛应用，原因可能在于需要相对复杂的仪器，根据不同应用使用不同的接口技术[17]。

2二维色谱分析技术在烟草行业中的应用

烟叶、烟气、烟用香精香料及烟叶农药残留中化学成分极其复杂，二维色谱技术具有很高的峰容量，能够研究这些物质中的复杂化学成分。

2.1烟叶分析

2010年，白军超等[20]建立了一种用于烟草样品中挥发性、半挥发性成分分析的液相色谱-毛细管气相色谱/质谱(LC-CGC/MS)离线联用方法。研究了LC-CGC/MS的分离机理，与直接采用CGC/MS分析相比，该体系的LC与CGC分离具有良好的正交性，大大减少了重叠峰出现的可能性，对复杂样本的分析效果更好，定性的可靠性更高。2013年，王晔等[21]采用溶剂萃取-中心切割多维气相色谱-质谱技术(MDGC/MS)建立了一种烟草主要中性香味成分的分析方法,并以甲基丁子香酚为内标，对茄酮、β-大马酮、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮和二氢猕猴桃内酯等中性香味成分进行了定性定量测定。各待测组分检出限在0.02～0.18 μg/mL之间，回收率为80.0%～123.4%，日内相对标准偏差≤7.5%。该方法快速、简便、准确，适用于烟草中性香味成分的批量测试。

2.2烟气分析

2011年，颜权平等[22]利用二维液相色谱方法测定12种卷烟样品卷烟主流烟气中7种主要酚类化合物，得出12种卷烟样品主流烟气中间苯二酚的释放量为0.72～2.15 μg/支。该方法能够准确定量卷烟主流烟气中的间苯二酚，同时不影响其它酚类物质的准确测定。2012年，杨菁等[23]采用全二维气相色谱-飞行时间质谱(GC×GC-TOF/MS)对优质烟叶单料卷烟主流烟气中中性化学成分进行分析，初步鉴定出匹配度大于700的1464种成分，重点讨论了中性香味羰基化合物全二维点阵的谱图特征，为烟气和复杂体系的深入研究提供了方法学基础。2014年，张权等[24]建立了超低温溶剂提取结合全二维气相色谱/飞行时间质谱(GC×GC-TOF/MS)测定卷烟主流烟气中有机酸类成分的方法。该方法利用超低温溶剂提取改进了现有分析烟气成分中存在的不足，在超低温状态下分离和富集卷烟主流烟气中的有机酸成分，在常温常压下解冻，使有机酸组分在低温态下直接溶解在提取溶剂中，既保证烟气中原有香气成分特征，又可对主流烟气中气相物和粒相物同时进行富集，结合全二维气相色谱/飞行时间质谱分析，提高了目标组分定性及定量分析的准确性，而且前处理操作简单，分析时间短，适合于批量样品的多种香气成分同时分析。

2.3烟用香精香料分析

2009年，熊围玺等[25]对一种烟用香精进行了定性分析，比较了不同分析结果所得化学成分和感官评吸结果之间的对应关系。这种分析方法分辨率高、峰容量大、灵敏度高、定性分析结果可靠，有利于更全面地认识香精的化学成分，能更准确地认识香精的组成与功能之间的关系，为增香配方研究的科学性、提高调香工作的效率提供了有力的技术支持。2012年，徐世娟等[26]建立了赖百当油的全二维气相色谱-飞行时间质谱(GC×GC/TOF-MS)指纹图谱，通过质谱库检索、保留指数比对、标准品同时进样验证与文献比较，共鉴定了108个组分，占挥发油总量的94.81%；首次用GC×GC/TOF-MS对赖百当油进行了分析，并初步进行了致香机理的阐释，为该植物的开发、调香应用和品控提供了技术支撑。

2.4烟叶农药残留分析

2008年，Cochran J[27]使用GC×GC-TOF/MS分析了烟草萃取液，利用峰自动查找和解谱软件对烟草萃取液中的14种杀虫剂进行了定性分析，该方法具有良好的线性响应和抗干扰能力。2010年，廖雅桦等[28]建立了用凝胶渗透色谱净化-液相色谱-串联质谱分析烟草中3种抑芽剂残留的方法。在卷烟样品中添加3种抑芽剂(添加水平为5，20，100 μg/kg)的混合标准溶液，平均回收率在86.2%～108.4%之间，3种抑芽剂的RSD在1.1%～7.5%之间；方法的检测限在0.01～0.06 μg/kg之间。该方法能够有效减少基质效应的干扰并且具有检测限低、灵敏度高、回收率和线性良好等特点，为烟草中多种抑芽剂残留的测定提供了参考。2014年，孙惠青等[29]建立了烟草中10种除草剂的GPC-GC分析方法，以进行烟草上除草剂快速检测。采用1%醋酸乙腈提取烟草中10种除草剂，经凝胶渗透色谱净化、气相色谱测定，外标法定量。10种除草剂在烟草中平均添加回收率为83.8%～100.1%，相对标准偏差为1.93%～8.91%，检测限为0.001～0.004 mg/kg。该方法操作简单、净化效果好、检测灵敏度和自动化程度高、具良好的准确度和精密度，能满足烟草样品中10种除草剂残留量的同时测定。

3二维色谱技术展望

烟草制品和烟气中的化学成分极其复杂，一维色谱的力不从心使得二维色谱备受欢迎。但从二维色谱的大量数据中提取有效数据却并非易事，功能强大、使用方便、界面友好的数据处理软件亟需开发。二维色谱(特别是LC-GC)中，更便捷、实用的接口技术有待开发。目前在烟草行业中全二维气相色谱已经得到广泛应用，二维液相和二维液气色谱还没有普遍应用，未来二者都会成为分析、检测烟草制品的有力工具。其中，在二维液气色谱中，超临界流体色谱和气相色谱联用将会备受欢迎，因为和普通高效液相色谱相比，超临界色谱处理温度低，在萃取、分离过程中挥发性成分不会损失，特别适合于挥发性成分分析，还可对香气成分进行族分离后再进行气相色谱分析，和常规气相色谱相比具有更高的峰容量，能获得更准确可靠的分析结果。

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(责任编辑：许晶晶)

Two-dimensional Chromatography and Its Application in Tobacco Industry

JING Lei-lei1,2, LIU Chun-bo1, ZHANG Feng-mei1, WU Yi-qin1, LIU Zhi-hua1,ZHANG An-feng1,2, YANG Guang-yu1, SHEN Qin-peng1*, MIAO Ming-ming1

(1. Research and Development Center, China Tobacco Yunnan Industrial Limited Company/Key Laboratory of Tobacco Chemistry of Yunnan Province, Kunming 650231, China; 2. College of Chemical Engineering, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China)

Abstract：The analysis of complex matrices is a very important area of separation science at present, the high peak capacity and the strong ability of separation and resolving power make two-dimensional chromatography a great advantage in the analysis of complicated compounds, and numerous combinations have been proposed and developed. Summarized the principle and other related contents of three different kinds of two-dimensional chromatography including two-dimensional gas chromatography, two-dimensional liquid chromatography and two-dimensional liquid chromatography gas chromatography, introduced each kind of two-dimensional chromatography according to classification, and summarized the application of two-dimensional chromatography in tobacco industry, finally the development trends of two-dimensional chromatography and its application in tobacco industry were prospected.

Key words：Two-dimensional chromatography; Gas chromatography; Liquid chromatography; Complicated compounds; Tobacco industry

收稿日期：2015-09-10

基金项目：云南省科技厅应用基础研究项目(2014FD078；2014FD079)；云南省创新团队建设项目(2009CI014)；云南中烟工业有限责任公司技术中心项目(JSZX2014JC04)。

作者简介：荆磊磊(1989─)，男，硕士研究生，主要从事烟草化学研究。*通讯作者：申钦鹏。

中图分类号：S572

文献标志码：A

文章编号：1001-8581(2016)04-0057-04