生物发光共振能量转移技术在蛋白酶活性检测中的应用

陈成娟，王伟



生物发光共振能量转移技术在蛋白酶活性检测中的应用

陈成娟，王伟

作者单位：100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验实验室/国家卫生和计划生育委员会天然药物生物合成重点实验室

生物发光共振能量转移（BRET）是 20 世纪中叶在海洋生物，例如维多利亚水母和软体珊瑚虫海肾中发现的一种自然现象[1]，能量从生物发光蛋白如荧光素酶（供体）转移到荧光物质（受体）。在软体珊瑚虫海肾中海肾荧光素酶将腔肠素氧化，发出波长为 480 nm 的光，与近距离的海肾绿色荧光蛋白之间发生一个非辐射的能量转移，发出 509 nm的光[1-3]。实际上，共振能量转移理论早在 1948 年就已经被 Förster 提出并被称为共振能量转移（Förster resonance energy transfer，FRET）[4]。根据供体不同，共振能量转移分为以荧光物质如荧光蛋白[5]、有机分子[6-7]、纳米无机荧光材料等为供体的 FRET 以及荧光素酶或者发光蛋白为供体的 BRET[8]。共振能量转移发生时，供体发出的部分光转移到受体荧光蛋白，受体发出波长更长的光。共振能量转移只有在受体分子的吸收光谱与供体分子的发射光谱有效重叠后才能发生。其发生取决于供体分子与受体分子的距离（一般在 1 ～ 10 nm）和两者的相对方向[9-10]。BRET 首次报道是用于检测细菌节律钟蛋白 KaiB 相互作用[8]，随后被广泛用于研究蛋白-蛋白相互作用（多数是蛋白偶联受体的二聚化和寡聚化的相关研究）[11-13]以及活体成像[14-16]等，同时 BRET 在蛋白酶检测及药物筛选中也发挥了巨大的作用[17]。

1　BRET 体系的特点

BRET 不需外源光激发，其背景极低，灵敏度高。与FRET 相比，BRET 能量供体为催化腔肠素发射荧光的荧光素酶，不需要外源光源激发荧光供体，更利于能量的定量转移，并且避免了 FRET 中强光源激发引起的很多副反应[18]，如光漂白[9]，直接激发受体，激发环境中的发光物质，损伤组织，光源光强被组织吸收而弱化等；同时 BRET 的另一个优势是可以分别对能量供体和受体进行定量[19]。BRET分析技术应用于生物体内生理活动的分析时不会对细胞组织造成有害影响，且可以实时监测，信号产生迅速，适合于高通量的筛选实验[20]。因此，在一些需要低背景和高灵敏的实验中，BRET 显示出巨大优势，在相关研究中发挥了重要的作用，解决了一些重要的分析问题，展现出良好的发展前景[21]。

2　BRET 体系中的能量供受体对及 BRET 衍生的技术

BRET 体系的供体是荧光素酶或发光蛋白，受体有荧光蛋白[22]、无机纳米材料及有机染料[23]。近年来，随着新型荧光素酶和荧光物质的发现和研究，越来越多的荧光素酶和荧光材料被用于 BRET 体系。

海肾荧光素酶（renilla luciferase，Rluc）是经典的 BRET供体，以腔肠素（coelenterazine，CLZ）为底物，发射峰在480 nm 处的蓝色-绿色可见光范围。Rluc 是分子量为 36 kD的单体蛋白，其 N-端、C-端均暴露在外，易于标记。近年来，腔肠素的多种衍生物被开发出来。其中腔肠素 400a，又称深蓝 C，经 Rluc 催化发射出主峰在 395 nm 的光。不同的 CLZ 衍生物底物最大发射波长不同，在高通量筛选实验中有着不同的特点。这使得 Rluc 在 BRET 技术中得到非常灵活的应用，能适应不同吸收波长的受体。

最早发展的 BRET 是以 Rluc 为供体，CLZ 为底物，增强型黄色荧光蛋白（enhanced yellow fluorescent protein，EYFP）为受体，可观察到两个最大发射峰，分别在 480 nm 和 527 nm，这种 BRET 体系被称为BRET1[22]。近年来开发的一些 YFP 突变体，如 YFP venus 也被应用到 BRET体系，取得了较好的结果[24]。

BRET2相比 BRET1最大的优势就是它的峰分辨率更高，更加灵敏。由于 Rluc 的发射峰与 YFP 的发射峰较为接近，重叠较严重，从而影响了实验的灵敏度，为此开发的BRET2体系弥补了这个缺点[25]。野生型 GFP 的突变体EGFP（F64L）最大吸收峰在 400 nm 左右，发射峰在 510 nm处。因此，Rluc 与 EGFP 构成的 BRET2体系，以 CLZ 400a 为底物时，发射出 395 nm和 510 nm 的特征峰，光谱分辨率大大提高，信噪比相应地得到提高。然而，CLZ400a发光很弱，比 CLZ 低 100 多倍。因此尽管 BRET2更加灵敏，但信号强度很弱，在很多实际应用中受到限制。美国斯坦福大学的 Gambhir 研究组将 CLZ400a 的类似物引入到 BRET2体系中使 BRET2载体被检测的时间延长到6 h[26]，且将 BRET2中的 Rluc 供体替换成其突变体 RLuc8 （RlucA55T/C124A/S130A/K136R/A143M/M185V/M253L/S 287L），使 BRET2体系检测灵敏度得到显著改善[27]。RLuc8发光强度是 Rluc 的 4 倍，能使 BRET 体系的信号增强大约 5 倍[28]，使用 RLuc8 作为 BRET 供体，EYFP 作为受体的 BRET1体系光输出增强 25 倍[29]。

尽管现有的 BRET1和 BRET2系统进行了如上所述的改进，但由于活体组织对在 600 nm 以下的发射光有强吸收，当应用于活体组织时仍然存在很强的光子衰减现象，这就导致该系统缺乏灵敏度和光谱分辨率低[30]。为满足小动物活体成像的需求，BRET 的发展趋势是选择合适的供受体，使 BRET 体系发射 600 nm 以上的红光或远红光。Gambhir 团队在此基础上开发了一系列新的 BRET 系统，即红移的生物发光共振能量转移系统，已成功应用于活体动物蛋白质-蛋白质相互作用的成像[31]。根据供体与受体以及所选用底物的差异分为 BRET3、BRET3.1、BRET4.1、BRET5、BRET6、BRET6.1等 6 类，供体是 Rluc 的突变体（RLuc8 或 RLuc8.6），受体是红色荧光蛋白的突变体（mOrange、TagRFP、TurboFP635），底物为 CLZ 或其合成的衍生物（CLZ-v）。当供体与受体不同时，其激发波长与发射波长的峰值也不相同。研究结果表明，其中 BRET3和 BRET6.1的能量转移效率相对较高。BRET3中 RLuc8 作为 BRET供体，红色荧光蛋白（DsRed2）的突变体 mOrange 作为BRET 的受体，用 CLZ 或 CLZ 的类似物 Enduren 作为底物。RLuc8-mOrange 的结合导致受体的发射处于橙色光谱区域（564 nm），同时在光强度方面也提高了数倍，具有较高的时间和空间分辨率，通过与光谱成像结合，在活的单细胞以及小动物模型的浅表和深部的组织结构中都能够对BRET 信号进行成像。BRET6和 BRET6.1系统都是使用突变体 RLuc8.6 作为 BRET 供体，TurboFP635 作为受体，两者分别催化底物 CLZ 和 CLZ-v 而产生相同的红光（635 nm）。由于该融合蛋白优良的光谱分辨率和红移的发射波长，因此无论在活的单细胞还是小动物模型的浅表甚至是深部的组织结构成像等方面都是有发展潜力的 BRET 系统。人们可以根据 BRET 方法各自的优缺点选择合适的BRET。

3　BRET 在蛋白酶活性检测中的应用

蛋白酶是生物体内一类重要的大分子，其功能的正常发挥维持着生命体正常的生理活动。许多病毒蛋白酶、细菌毒素等活性的发挥对正常的机体造成伤害，是重要的药物靶标[32-35]。因此，分析监测蛋白酶活性，对于探究生命体生理活动机制和研发相关蛋白酶抑制剂等研究具有重要指导意义。BRET 严格依赖距离的特性为构建蛋白酶传感器提供了理论的可行性。Helen Dacres 研究组在 2008 年研究发现运用 BRET2实时检测凝血酶浓度灵敏性比运用 FRET 高50 倍，这也直接说明 BRET2比 FRET 更适合用来检测蛋白酶活性[36]。典型的设计（图1）是在供受体间连接一段易被蛋白酶特异切割的短肽，保持供受体距离足够近而发生共振能量转移，活性蛋白酶特异地识别并剪切 BRET 融合体系的连接肽，供受体不再受约束而彼此分开，BRET 作用减弱或消失。通过观察 BRET 能量转移的变化就能测定活性蛋白酶的活性和表达量。下面以实验所运用 BRET 技术为分类标准综述该技术在蛋白酶检测中的应用（表1）。

图1　BRET 蛋白酶传感器典型设计示意图[37]

3.1CRET（Chemiluminescence resonance energy transfer）Waud 等[38]首次将 BRET 用于蛋白酶的活性检测，将水母素作为能量的供体，GFP 或 EGFP 作为能量的受体，在酶学水平检测了 α-凝血酶的活性，在细胞水平检测了半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的活性。该文中能量供体选用水母素而非 BRET 系统中常用的海肾荧光素酶，并将此BRET 系统命名为 CRET。

表1　BRET 在蛋白酶活性检测中的应用

3.2BRET1

Dacres 研究组分别构建了凝血酶和 caspase-3 的BRETl（Rluc/YFP）和 BRET2（Rluc/GFP2）传感器，体外检测了凝血酶和 caspase-3。对于凝血酶的检测限达到了pmol/L 级，方法简单且灵敏度高[39]。通过同种蛋白酶的两种 BRET 传感器的检测结果比较，BRET2的灵敏度是BRET1体系的 2.9 倍，检测限低 2.5 倍。证实了 BRET2体系比 BRETl更加灵敏，这也正是 BRET2应用更为广泛的原因。

3.3BRET2

Hu 等[40]应用密码子人源化的 Rluc（hRluc）和 GFP2（hGFP2）构建的 BRET2体系检测 HIV-1 蛋白酶活性及其抑制剂的生物活性。构建原理是在 hRluc 和 hGFP2中间插入含有蛋白酶特异切割位点的肽段 p2/p7。在含有 HIV-1蛋白酶基因及缺失该基因的细胞内表达这种融合蛋白时，含有 HIV-1 蛋白酶基因的细胞中 BRET2信号降低，而缺失该基因的细胞中 BRET 信号保持稳定。向含有 HIV-1 蛋白酶基因的细胞加入 HIV-1 蛋白酶抑制剂 saquinavir 或amprenavir，或者改变蛋白酶切割位点序列都能抑制蛋白酶的活性而使 BRET 现象保持稳定。这种蛋白酶 BRET2生物传感器测定法可适于高通量筛选新的 HIV-1 蛋白酶抑制剂，同时它也可用于筛选针对其他病毒蛋白酶的抗病毒化合物。

Oka 等[37]应用 BRET2系统在细胞水平检测猫杯状病毒（feline calicivirus，FCV）蛋白酶活性。该病毒常被用作不可培养的杯状病毒的研究模型。实验中荧光强度随病毒的滴度而变化，该方法可以作为筛选 FCV 蛋白酶抑制剂的模型。

2012 年，Dacres 等[41]改进了凝血酶 BRET2传感器，使用 Rluc 的两个突变体 Rluc-2 和 Rluc-8 作为 BRET2的供体，构建了新的凝血酶 BRET2（Rluc2/GFP2和RLuc8/GFP2）传感器，进一步提高了凝血酶检测的限度。

3.4QD/BRET 系统

量子点（quantum dot，QD）是近年来研究很热的新型纳米荧光材料，直径在 1 ～ 100 nm，具有量子产率高，稳定性好，吸收光谱宽，Stokes 位移大，发射波长可调等优点，被广泛应用于生物分析领域[51-55]，在作为BRET 受体方面也有研究报道。Rao 研究组 2006 年利用 RLuc8 与表面带有活性羧基基团的 QD655 通过氨基-羧基形成酯键共价偶联，构建了一种发射光红移的 BRET 探针，具有光谱分辨率高，发射红色光的优点，成功进行了较深组织和活体的示踪[56-57]。使用紫外或蓝色光区的激发光就能激发 QDs，发射光遍及蓝色到红色光区。因此，QD 作为 BRET 受体具有巨大的应用潜力。QD 作为受体最大的限制因素是它不能与 Rluc 等荧光素酶在基因水平上进行偶联，在体内应用方面很受限制。2007 年 Rao 研究组报道了 RLuc8/QD 体系应用于基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的分析[42]。RLuc8 的一端融合了一段带有 MMP-2特异识别序列 GGPLGVRG 的 6xHis 标签，表面带有羧基的 QD655（发射光为 655 nm）能通过 Ni2+与 RLuc8 蛋白分子偶联。用一定浓度的 MMP-2 处理带有该标签的RLuc8 时，连接肽被切割，RLuc8 分子与 His 标签分离，与 His 标签结合的 QD655 无法靠近 RLuc8，不能发生BRET 作用；而未经 MMP-2 处理，带有 His 标签的RLuc8 在 Ni2+的作用下与 QD 偶联，发生 BRET 作用。通过 BRET 比值的计算就能测得 MMP-2 的浓度。由于该工作是在蛋白酶活反应之后再与受体 QD655 通过His-Ni2+-COOH 之间的配位键连接，结合力不够强，背景较高。此后，2008 年他们再次改进了该体系，使用内含肽来共价连接 Rluc 与 QD[43-44]。未反应的 Rluc 能够很容易地从体系中除去，降低了背景。这种 Rluc/QD 体系不仅检测了缓冲液中的蛋白酶 MMP-2，还成功检测了小鼠血清中的 MMP-2。通过使用不同发射光的 QD 还可实现同时检测多种蛋白酶。例如，选择 QD655 和QD705 分别构建Rluc/QD 体系，每种体系含有一种蛋白酶特异的酶切位点。可使用包含两种蛋白酶特异识别位点的 BRET 体系混合物，同时检测了两种蛋白酶。这个方法对于 BRET 体系在多重检测中的应用做了尝试。2010 年他们利用纳米金颗粒（gold nanoparticle，AuNPs）能够淬灭荧光分子的这一荧光性质，设计了一种新型的 MMP-2 检测传感器 RLuc8/Au NPs体系[45]。中科院张先恩研究组利用富勒烯的两个衍生物与人源化的 Gaussia 荧光素酶（hGluc）偶联，用于分析α-凝血酶的活性，检测限达到 14 pmol/L[46]。

Chen 等[47]构建了一种新的 pRluc/AuNPs 凝血酶无创检测传感器，并在添加尿液的溶液中检测了凝血酶，传感器检测凝血酶的响应时间为 10 min 左右，检测限为 80 pmol/L。

3.5溶液环境改进的 BRET 系统

由于 BBRT 中供体、基底及受体的敏感性，BRET 效率对溶液环境极其敏感。但目前关于溶液的各种组分是如何影响 BRET 的效率，又是如何影响检测蛋白酶的活性分析，一直以来都没有系统的研究报道。Li 等[48]利用 hGluc 作为供体，EYFP 作为受体，系统研究了溶液环境对 BRET 效率的影响。结果发现溶液环境包括缓冲溶液的组成、pH、二价离子等均能显著影响 BRET 的效率。基于以上结果，他们优化得到一种灵敏高、低成本的基于 BRET 技术的蛋白酶检测新体系，能使 BRET 效率提高到最好，从而极大地提高了 BRET 传感器检测肠激酶的性能，能将蛋白酶的检测灵敏度提高 10 倍及检出限提高 7 倍。这个系统能用于提高其他 BRET 传感器对蛋白酶检测的性能，特别是对于一些活性受环境影响较大的蛋白酶。Li 等[49]还构建了一种新的hGluc-tdTomat BRRT 系统，该系统具有非常好的光谱分辨率，△λ 达 110 nm，在体外纯缓冲液中检测肠激酶的检测限为 2.1 pmol/L，含有 3% 血清的溶液中检测限为 3.3 pmol/L。

2014 年，Wu 等[50]将 BRET2凝血酶传感器再次进行改进，与微流检测系统结合代替传统的静态微孔检测。新的传感系统称作 BRETH（经典的 BRET2系统，CLZ 做底物）生物探针，并对该 BRETH生物探针 BRET 比率的影响因素即检测的位置、流速、探针的浓度进行了定量分析。该BRETH凝血酶生物探针最低检测限是 27 pmol/L，而静态的微孔检测最低检测限为 310 pmol/L。

利用 BRET 技术分析蛋白酶的活性可用于蛋白酶活性抑制剂和蛋白酶靶标的筛选，由于很多与疾病相关的生理过程均有蛋白酶的参与，因此蛋白酶抑制剂的开发是疾病控制与治疗的重要发展方向。结合上述报道的应用实例，利用BRET2体系分析 HIV-1 蛋白酶的活性，通过观察活性物质作用下酶活的变化引起的 BRET 信号变化，能够确定其是否具有 HIV-1 蛋白酶的抑制活性。通过这种方法，鉴定了已报道的两种抑制剂，证实了一种新的抑制剂。此外，Rluc/QD 体系在检测蛋白酶 MMP-2 的良好表现使其具有进一步筛选 MMP-2 抑制剂的巨大潜力。

4　BRET 技术的展望

基于生物发光的 BRET 技术己经被证明是一种有效的、多功能的生物分析工具，适用于研究蛋白-蛋白相互作用、细胞及活体影像、蛋白酶活性监测、药物筛选等众多领域。在研究机体重要生理过程，揭秘生命体重要生理事件，阐明其分子机制，开发药物等应用中，BRET 技术作为一种重要的分析工具，发挥了越来越重要的作用，为生物医学的进步做出了巨大贡献。BRET 技术针对医学、制药和环境的目标分析物进行的超灵敏检测和高通量筛选，顺应了现代科学对分析技术的发展和要求。

尽管 BRET 有着背景极低，灵敏度高等显著的优点，现有的 BRET 技术同样也存在一些缺陷。应用最广泛的BRET 体系所依赖的荧光素酶 Rluc 其量子产率较低，约束了进一步发展高效、高灵敏的 BRET 体系。此外，应用较多的 BRET 体系其发射光位于 600 nm 以下的蓝色到橙色光区，不利于进行细胞及活体研究。新型的 BRET 体系应该具备发光强度高，酶活稳定性高，发光稳定的供体，谱分辨率较高。为适应体内研究，新型 BRET 体系应具备 600 nm以上的红色发射光，可基因水平操作。

随着科学的日新月异，大量新型荧光素酶和荧光物质得到了开发和应用，这些都成为未来 BRET 技术发展的技术储备。随着科学技术的不断进步，分析技术的不断完善，BRET 技术也将不断得到完善和发展，必将在科学研究的广阔领域里发挥越来越重要的作用。

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·综述·

收稿日期：2015-11-17

通信作者：王伟，Email：wwang@imm.ac.cn

基金项目：国家自然科学基金（30772677、81072562）；“重大新药创制”国家科技重大专项（2012ZX09301002）

DOI:10.3969/j.issn.1673-713X.2016.01.010