乳制品中玉米赤霉醇类药物残留检测——液相色谱-串联质谱法

□陈小芳 广州市增城质量技术监督检测所

乳制品中玉米赤霉醇类药物残留检测
——液相色谱-串联质谱法

□陈小芳 广州市增城质量技术监督检测所

通过此次研究得到了较好的测乳制品中玉米赤霉醇类药物残留的高效、准确的方法。乳制品中的玉米赤霉醇类化合物经乙腈提取、正己烷脱脂、过MAX柱净化浓缩后，供液相色谱-串联质谱仪测定。玉米赤霉醇类化合物在0～10 μg/L内均具有良好的线性关系，方法检出限为1.0 μg/L,定量限为2.0 μg/L，6种玉米赤霉醇类化合物的平均回收率为99.5%～105.14%，相对标准偏差为0.73%～14.88%。该方法灵敏度高，准确度高，用于乳制品中玉米赤霉醇类化合物的测定，可获得满意的结果。

乳制品；玉米赤霉醇类；液相色谱—串联质谱法

1 玉米赤霉醇类化合物简介

玉米赤霉醇类化合物的残留问题曾经多次出现在公众视线，例如玉米赤霉醇作为牛羊促长剂，以耳根埋植的形式应用，促进蛋白质的合成，提高酮体瘦肉率及饲料转化率。但玉米赤霉醇具有弱雌激素作用，在动物尿液中的残留会引起机体性机能的紊乱，影响第二性征的正常发育，在外部条件诱导下，还可能致癌，且排出动物体外后，还可经饮水和食物造成二次污染和环境污染[1]。玉米赤霉烯酮具有较强的生殖毒性和致畸作用，可引起动物雌激素亢进症，导致动物不孕或流产，对家禽、猪、牛和羊影响较大，给畜牧业带来很大的经济损失[2]。据相关文献报道，在世界各地各种粮谷和饲料中均有玉米赤霉烯酮存在。对此，世界多个国家都出台相关政策，严格控制玉米赤霉醇类药物的残留限量[2]。另据《中国畜牧兽医报》报道，我国农业部畜牧业司已向各省区市畜牧主管部门发出通知，严禁玉米赤霉醇（又名畜大壮、牛羊增重剂）埋植剂用于畜牧业生产。研究玉米赤霉醇类药物残留任重道远，此文研究的玉米赤霉醇类化合物有α—玉米赤霉醇、β—玉米赤霉醇、α—玉米赤霉烯醇、β—玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮。α—玉米赤霉醇是玉米赤霉烯醇的衍生物，而玉米赤霉烯酮的衍生物有α—玉米赤霉烯醇、β—玉米赤霉烯醇。玉米赤霉烯酮溶于碱性水溶液、乙醚、苯、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈和醇类溶剂，微溶于石油醚，不溶于水[3]。玉米赤霉醇，溶于碱性水溶液、乙醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇等有机溶剂，微溶于石油醚。

目前，玉米赤霉醇的测定方法有薄层色谱法（TLC）、酶联免疫法（EIA）、气相色谱-质谱法（GC-MS）和高效液相色谱—紫外检测法（HPLC-UA）等[4]。玉米赤霉烯酮的检测方法大致分为化学检测方法和免疫学检测方法[5]，化学检测方法包括薄层色谱法、气相色谱—质谱联用法、高效液相色谱法和液谱—质谱联用法；免疫学检测方法包括酶联免疫吸附测定法和免疫胶体金快速诊断技术。但因为每种方法均有一定的局限性，综合了液相色谱和质谱的优缺点后，本文选用液相色谱—串联质谱法测定目标物。

样品的提取和净化方法通常采用液-液分配和以氨基、C18、氧化铝为固相萃取预柱的SPE方法，这些方法大多操作繁琐耗时，而且需要大量的有机溶剂, 在回收率、准确度和精密度等方面都难以取得理想的效果[6]。本实验采用MAX固相萃取柱进行净化浓缩，可得到较为理想的效果。

2 实验部分

2.1 试剂和仪器

2.2.1 试剂

甲醇，正己烷，乙腈，乙酸乙酯，氢氧化钠，水硫酸钠，氨水。

甲醇-氨水-水：准确量取甲醇5 mL、氨水5 mL、水90 mL，混匀。

2%乙酸乙腈：移取2 mL乙酸，量取98 mL乙腈，混匀。

标准储备液（100 μg/mL）：精确取适量的α—玉米赤霉醇、β—玉米赤霉醇、α—玉米赤霉烯醇、β—玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮，用甲醇分别配成浓度为100 μg/ mL的标准储备液，-20 ℃冰箱中保存。

混合标准储备液（1 μg/mL）：分别准确吸取1.0 mL的α—玉米赤霉醇、β—玉米赤霉醇、α—玉米赤霉烯醇、β—玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮标准储备液至100 mL的容量瓶中，用甲醇稀释定容，-20 ℃冰箱中保存。

以上所用试剂，除特殊注明外均为分析纯试剂，水为符合GB/T 6682规定的一级水。

2.2.2 仪器

液相色谱-串联质谱联用仪（配电喷雾离子源），涡旋振荡器，水平振荡器，冷冻高速离心机，组织匀浆机，氮吹仪，固相萃取装置，Oasis MAX固相萃取柱，规格为60 mg，3 ml。

2.2 材料

新鲜或解冻的牛奶、奶酪、酸奶等乳制品。

2.3 样品处理

称取待测样品3～7 g于50 mL带塞离心管中，加入浓度为10 mg/L的内标50μl，无水硫酸钠约2 g和乙腈10.00 mL，用匀质器混匀，然后用另一装有乙腈10 mL的50 mL离心管，洗刀头，合并两次提取液。在水平振荡器上振荡15～20 min。4000 r/min离心5min。取上清液12 mL于另一大试管中，加正己烷10.00 mL，振荡5 min，冷冻高速离心机上离心5min后吸去上清液，余液于50 ℃下吹氮至0.1 mL以下。加水10.00 mL，用3 mol/L氢氧化钠调节pH至11，4000 r/min离心5 min，待净化。

2.4 净化富集

将待净化液过MAX固相萃取柱，依次用甲醇-氨水-水1 mL和甲醇0.5 mL淋洗，接着用2%乙酸乙腈4 mL洗脱并收集洗脱液后，于50 ℃下吹干。残余物加乙腈0.5 mL，涡动1 min，加水0.5 mL，混匀后过0.2 μm有机滤膜以供液相色谱—串联质谱仪测定。

2.5 色谱质谱条件

2.5.1 液相色谱参考条件

色谱柱：Sunfire C18柱，100 mm×3.0 mm（i.d.），3 μm；流动相：A相为乙腈，B相为0.02%乙酸水溶液；流速：0.2 mL/min；柱温：35℃；进样量:10 μL。

梯度洗脱条件见表1。2.5.2 质谱参考条件

2.5.2.1 离子源和气体设置

负TurboIonspray电离源（ESI）；雾化气（NEB）和气帘气（CUR）：N2,设置值分别为10和7；加热辅助气：N2,流量8 L/min；离子源温度（TEM）：500 ℃；电离电压（IS）：-3 500V；碰撞气（CAD）：N2,设置值为10。

2.5.2.2 监测模式和参数设置

采用多反应选择离子监测方式（multiple reaction monitoring, MRM）。

Dwell（msec）：100；DP：-70；CXP：-10；FP：-200；EP：-5；其余参数见表2。

2.5.3 液质联用的测定

按表3分别吸取适量的浓度为0.1 mg/L的玉米赤霉醇类标准工作液、1.0 mg/L玉米赤霉醇-D4内标溶液，流动相至液相色谱进样瓶中，混匀备用。临用前配制。

3 结果与讨论

3.1 样品的提取与净化

3.1.1 提取方法的选择

玉米赤霉醇类化合物极性极高，在样品的提取阶段，应选择具有适当极性的提取剂。参考相关资料可知，通常情况下，选用的提取溶剂有甲醇、乙腈、乙腈水溶液。当样品为牛奶、奶粉等待测样时，通常用乙腈进行提取，因此，在本实验方法选择乙腈作为提取剂。另外，由于乳制品的粘性较大，均质时不能完全分开，甚至大量的样品黏在均质器的刀头上，为了能使样品与提取剂充分接触，本实验在均质前，向样品中加入约2 g无水硫酸钠。另外针对黄油熔点较低，在28℃左右会软化，34 ℃以上就会液化，在加内标前，把装有样品的离心管置于50 ℃水浴中，使待测黄油完全熔化后，再按2.3操作。

3.1.2 净化条件的优化

由于乳制品中脂肪含量过高，过柱时容易堵塞柱的孔径，因此，在通过固相萃取柱之前，需要加入正己烷，进行脱脂处理。

在相关文献[7]中可知，动物源性食品中玉米赤霉醇类化合物残留检测常应用NH2柱（离子交换萃取小柱）或MAX柱（混合型强阴离子柱）。使用500 mg，6 ccNH2柱的结果比200 mg，3 cc NH2柱得到的结果要好且较为理想。而应用60 mg，3 ccMAX柱得到的结果就已经达到500 mg，6 cc NH2柱的结果。鉴于后者价格较前者价格昂贵，所以本实验选用60 mg，3 ccMAX柱进行净化处理。

3.1.3 淋洗液与洗脱液的选择

在此方法中，分别配备了3种不同浓度的淋洗液和洗脱液，分别为甲醇-氨水-水（5+5+90，v/v/v），甲醇-氨水-水（5+10+85，v/v/v），甲醇-氨水-水（10+5+85，v/v/v）；1%乙酸乙腈，2%乙酸乙腈，3%乙酸乙腈。然后进行试剂空白实验，结果如图1、图2所示。

因为玉米赤霉醇类化合物的回收率为60%～120%，由图1可知，分别用甲醇-氨水-水（5+10+85，v/v/v），甲醇-氨水-水（10+5+85，v/v/v）作为淋洗液时，玉米赤霉醇类化合物的回收率均超过120%，因此淋洗液应选择甲醇-氨水-水（5+5+90，v/v/v）。由图2可知，1%乙酸乙腈，3%乙酸乙腈作为洗脱液时，玉米赤霉醇类化合物的平均回收率也是超过120%，因此应该选择2%乙酸乙腈作为洗脱液。

3.2 线性范围、检出限和定量限

用空白样品制备样品空白提取液，用该提取液将标准液稀释成0、1.0、2.0、5.0 μg/kg和10.0 μg/kg溶液，各组分的浓度（y，μg/kg）与对应的峰面积（x）比值呈现良好的线性关系，其相关参数见表3。该方法测定乳制品中6种玉米赤霉醇类化合物的检出限为1.0 μg/kg，定量限为2.0 μg/kg。

3.3 回收率与精密度

采用乳制品，如奶油、奶酪、酸奶进行添加回收和精密度实验，样品中添加不同浓度的标准溶液，使其含量水平分别为1.0、2.0、5.0 μg/L，充分摇匀，使标准溶液与样品混合均匀，按照本实验条件进行回收率测定，每个添加水平重复测定6次，其回收率和精密度见表4，表5，表6。

由上表可知，6种玉米赤霉醇类化合物的平均回收率为99.5%～105.14%，相对标准偏差为0.73%～14.88%。

4 结论

采用液相色谱-串联质谱法检测乳制品中玉米赤霉醇类化合物残留，采用内标法定量。此法用乙腈作为提取剂，并针对在提取过程中样品不能很好地分离，提取时加入无水硫酸钠并匀质处理，乳制品脂肪含量较高，为了不堵塞净化柱，在过柱前加入正己烷进行脱脂后再过60 mg 3 ccMAX柱，最后选择甲醇-氨水-水（5+5+90，v/ v/v）为淋洗液，2%乙酸乙腈为洗脱液，最后用0.5 mL乙腈和0.5 mL水定容，过0.2 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

该方法的检出限为1.0 μg/kg。具有特异性强、灵敏准确等特点。经多次试验证明，此方法稳定、回收率以及精密度可以满足试验工作的要求。

[1]张晓东,朱叶青,朱惠珍.LCMS/Ms法测定牛肉中玉米赤霉醇的残留[J].北京药学,2008(3):13-15.

[2]庞凌云，祝美云，李瑜.玉米赤霉烯酮检测方法研究进展[J].粮食与油脂,2009(7):39-41.

[3]罗小虎.高效液相色谱法测定玉米赤霉烯酮的方法研究[J].食品科技,2010(1):266-270.

[4]张岩,李挥，张敬轩，等.快速高分离液相色谱-串联质谱法测定植物组织中雌激素玉米赤霉醇类化合物[J].分析化学，2009,37(11):1683-1686.

[5]王元凯,王君，严亚贤.玉米赤霉烯酮检测方法研究进展[J].中国公共卫生,2009,25(9):1100-1101.

[6]孟娟,张晶,张楠，等.固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法检测粮食及其制品中的玉米赤霉烯酮类真菌毒素[J].色谱,2010,28(6):604-607.

[7]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法(GB/T 22992-2008) [S].北京:中国标准出版社,2008.