猪细小病毒分子生物学诊断技术及基因工程疫苗的研究进展

李天芝，于新友，谢金文，沈志强

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600）

猪细小病毒分子生物学诊断技术及基因工程疫苗的研究进展

李天芝1，于新友1，谢金文2，沈志强2

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600）

文章论述了猪细小病毒分子生物学诊断方法，包括常规PCR方法、多重PCR方法、荧光定量PCR方法、环介导等温扩增技术、基因芯片等，并就其基因工程疫苗方面的研究进行了着重阐述。

猪细小病毒；分子生物学诊断；基因工程疫苗

猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）可引起母猪发生流产、产死胎、产畸形胎、胎儿木乃伊化和不孕等，初产母猪受到的危害最为严重[1]。PPV为细小病毒科细小病毒属成员，只有一个血清型，为单股线状负链DNA病毒，基因组大小约为5 000 bp，共编码3种结构蛋白VP1、VP2、VP3和3种非结构蛋白NS1、NS2、NS3。1966年Mary和Mahnel首次发现该病毒，后来证实了其致病作用[2]，PPV在世界各地广泛流行[3]，1983年，我国首次发现该病，随后在四川、浙江、吉林和上海等地均有相关报道[4]。一旦PPV传入阴性猪场，可在3个月内感染猪场所有猪，在本病发生后，猪场可能连续几年不断地出现母猪繁殖失败[5]。PPV常和猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）、乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）、猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）等混合感染而加重了其危害，给世界养猪业带来巨大的经济损失[6]。近年来，各国专家学者对PPV分子生物学诊断技术及基因工程疫苗进行了大量的研究，本文就研究进展情况综述如下。

1 分子生物学诊断

1.1 常规PCR方法

PCR方法是根据目的片段序列设计引物，借助仪器和DNA聚合酶体外大量扩增部分或全部目的片段，是一种快速、简便、特异的诊断方法。刘业兵等[7]建立了PPV PCR检测方法，可成功扩增出1 980 bp预期片段，该法特异性好，对其他猪病毒的检测结果均为阴性，敏感性强，可检测到0.9 TCID50、0.001个HA的病毒。崔宇超等[8]根据PPV VP2基因的保守区域设计1对扩增472 bp片段的特异性引物，建立了PPV纳米PCR检测方法，该法检测敏感性是普通PCR的1 000倍，最低核酸检出量为4拷贝/μL。对其他相关病毒核酸检测结果均呈阴性。分别采用纳米PCR和普通PCR对3个省份送检的43份临床样品进行检测，PPV阳性率分别为95%（41/43）和75.6%（31/41），表明该纳米PCR检测方法具有更高的敏感性，适用于PPV低含量临床样品的检测。

1.2 多重PCR方法

多重PCR是一种特殊的PCR技术，它在同一PCR体系中，加入多对引物，同时检测2种或2种以上的病毒DNA，它具有快速、灵敏度高、高效、特异性强等优点而广泛用于临床的快速诊断。岳丰雄等[9]建立了一种能够同时检测PCV2、PPV、PRV、PRRSV的多重PCR方法，分别可扩增PCV2 ORF2基因353 bp片段、PPV NS1基因271 bp片段、PRRSV MN基因美洲型434 bp片段、PRV gB基因194 bp片段。该方法具有很好的特异性，对猪瘟病毒、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性，敏感性高，对PPV、PRV、PRRSV和PCV2的最低检测量分别为8.64×10-3、2.36×10-3、3.68×10-3、2.90×10-4μg。朱向博等[10]根据GenBank中PPV VP2基因和猪源脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus,EMCV）3D基因，采用Primer Premier 5.0软件设计出PPV和EMCV的特异性引物。通过优化反应条件，建立了能同时特异性检测PPV和EMCV的二重PCR方法，PPV和EMCV的敏感性检测极限分别达7.62和1.22× 10-1pg/μL。谢燕婷等[11]利用DNAstar软件对PRV gB基因、PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因的保守区设计引物，对PRV、PCV2和PPV扩增片段的大小分别为373、430和495 bp，对PRV、PCV2和PPV核酸检测的敏感性分别为1.62×10-6、1.47×10-6和1.28×10-4ng，对灭菌双蒸水、猪繁殖与呼吸综合征病毒cDNA和猪瘟病毒cDNA的mPCR扩增结果均为阴性。于新友等[12]根据GenBank中登录的PCV2和PPV核苷酸序列，分别设计2对引物，在建立各病毒单项PCR技术的基础上，优化双重PCR反应条件，建立了2种病毒的双重PCR检测方法，用这2对引物对同一样品中的PCV2和PPV核酸模板进行双重PCR扩增，结果可同时扩增PCV2的245 bp、PPV的475 bp的特异性片段，而对其他4种病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明，该双重PCR技术能检出1 pg的PCV2和1 pg的PPV模板。

1.3 荧光定量PCR方法

荧光定量PCR技术是指采用SYBR GreenⅠ荧光染料或荧光探针通过连续监测荧光信号强弱的变化来测定特异性产物的量，不需要分离PCR产物，即能准确定量起始模板数。黄律等[13]根据Gen－Bank中发表的PPV4型全基因组序列，针对其结构蛋白VP2基因的保守序列，设计1对引物，建立了PPV4的Taq Man荧光定量PCR。该法在6.73×109copies/μL至6.73×101copies/μL范围内线性关系良好，相关系数为0.998，对PPV4的最低检测限为6.73×101copies/μL。特异性试验结果显示，用该方法检测其他基因型PPV、PRRSV、猪瘟病毒及PCV2等临床常见病毒，结果均为阴性，批内及批间变异系数均低于2%。沈志强等[14]根据GenBank登录的PPV VP2基因序列设计1对引物，建立了检测PPV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法，结果显示，标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系，R2=0.997 6，产物Tm为82.3～82.9℃，检测灵敏度为72.1拷贝/μL，特异性和重复性良好。容新宗等[15]根据PPV的VP2基因保守序列，设计并合成引物，对目的片段进行PCR扩增，将扩增的PPV VP2基因片段克隆入PMD19-T载体，重组质粒PMD19-T-VP2经测序鉴定正确后，作为标准品模板，建立了以EvaGreen为染料的实时荧光定量PCR检测PPV的方法，结果显示，用重组质粒PMD19-T-VP2制作的荧光定量PCR扩增曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系，该方法检测灵敏度的下限能达到102copies/μL，与其他DNA病毒和同种属的细小病毒无明显的交叉反应，连续重复检测高、中、低浓度样品，批内批间变异系数小，重复性好。郑兰兰等[16]根据GenBank中登录的基因序列，分别设计了2对针对PRV gH和PPV NS1基因的引物，建立一种能快速、灵敏、同时检测出PPV与PRV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。结果显示，PPV与PRV荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为80.9℃和86.5℃，熔解曲线特异，灵敏度分别可达248拷贝/μL和160拷贝/μL，是普通PCR检测方法的100倍。余波等[17]根据GenBank中PPV VP2基因序列设计特异性的引物，PCR扩增获得PPV VP2基因片段，并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR GreenⅠ荧光定量PCR反应条件的优化，建立了PPV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR诊断方法，以此为基础研制出试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰，无引物二聚体，对PRV、PCV2、E.coli、猪瘟病毒、PRRSV均无阳性信号扩增，可重复性好，测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL。

1.4 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplication,LAMP）是在等温条件进行扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步完成，扩增效率和特异性高，可在15～60 min扩增109～1010倍，可只通过扩增产物的有无来判别。刘业兵等[18]据GenBank公布的PPV序列，在其保守序列区域设计了多套LAMP引物，建立了对PPV LAMP检测方法，结果显示，该法在63℃恒温下作用45 min，PPV DNA获得了高效率的特异性扩增，其检出限量为0.23 TCID50，敏感性高，在反应结束后加入SYBR GreenⅠ肉眼判断结果，与Real Time Turbidimeter LA-320仪监测结果一致。黄书林等[19]针对PPV NS1基因保守区域设计6条特异引物，建立了一种灵敏、特异、快速的PPV LAMP检测方法，该法在63℃的等温条件下45 min即可完成反应。最低检测限量为10拷贝的PPV目的基因，比常规PCR法敏感100倍，具有良好的特异性。以钙黄绿素和Mn2+作为荧光指示剂，可快速、直观判定反应结果。陈星瑶等[20]建立了快速检测PPV的LAMP方法，通过优化反应条件，扩增温度60℃、62℃、64℃和66℃均可以，最佳扩增时间为45 min，最低可检测10拷贝的PPV核酸模板量，特异性良好，对猪链球菌、PRRSV、猪水疱病病毒、PRV、猪瘟病毒、猪流感病毒、O型口蹄疫病毒、猪蓝耳病病毒和水扩增结果均为阴性，不需要电泳检测反应结果，只需向产物管内加SYBR GreenⅠ荧光染料，肉眼观察，阳性反应管颜色立刻变为黄绿色，且模板浓度不同颜色有深浅变化，结果容易判定，适于临床推广。

2 基因工程疫苗

2.1 核酸疫苗

构建含有外源抗原基因的重组质粒，免疫动物后，表达的特异性抗原蛋白通过与MHC-Ⅰ类或MHC-Ⅱ类抗原分子结合，刺激机体产生特异性免疫应答，该类疫苗称为核酸疫苗，又名DNA疫苗。王印等[21]构建了含有PPV VP2基因核酸疫苗pcDNAVP2，肌注BALB/c小鼠，作间接ELISA抗体检测试验，并采用淋巴细胞增殖试验（MTT法）和流式细胞仪（FACS）法对小鼠的细胞免疫进行检测。结果表明，pcDNA-VP2能诱导小鼠产生细胞免疫和体液免疫应答。梅淼等[22]构建了重组质粒pCI-IFN-γ.ORF2. VP2和pCI-ORF2.VP2，分别将重组质粒肌肉注射免疫小鼠，并设pCI-neo、PBS、PPV灭活苗和猪圆环病毒亚单位疫苗免疫组做对照，检测小鼠不同时期的淋巴细胞转化功能、T淋巴细胞亚群动态变化情况以及PPV、PCV2抗体水平。结果显示，pCI-IFN-γ. ORF2.VP2免疫组从第7天开始脾淋巴细胞对ConA有明显反应，显著高于对照组和pCI-ORF2.VP2免疫组，CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组和pCI-ORF2.VP2免疫组，在免疫后第14天检测到PPV、PCV抗体。说明pCI-IFN-γ. ORF2.VP2能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。孙彦欣等[23]将PCV2编码T细胞表位P21多肽的序列连接于PPV VP2基因的5'端克隆于pcDNA3.1（+）中，构建重组表达质粒pcDNA-P21-VP2，将其肌肉注射BALB/c小鼠后，检测免疫相关指标，结果显示，重组质粒能够有效诱导小鼠产生明显的抗体反应，并且对淋巴细胞的增殖反应有明显促进作用。

2.2 活载体疫苗

采用弱毒或无毒病原微生物作为表达载体，对其导入外源抗原基因，制成疫苗后，接种动物，诱导机休产生特异性免疫应答反应，这类新型疫苗称为活载体疫苗。徐义刚等[24]将构建的重组PPV VP2基因的细胞表面表达型载体pPG-VP2电转化干酪乳杆菌L.casei393，获得阳性重组菌pPG-VP2/L.casei393。将重组菌及空质粒菌株分别口服接种BALB/c小鼠，收集粪便及肠黏液样品测定小鼠产生抗VP2的特异性sIgA，采集血液样品测定小鼠产生抗VP2的特异性IgG，并对获得的抗体进行PPV中和活性的测定。结果显示，该重组菌能诱导小鼠产生高水平的抗PPV sIgA和IgG抗体水平，其对PPV的中和效价分别为1∶24和1∶128。王林青等[25]将PPV VP2基因和猪IL-18基因分别插入到PRV转移质粒PG中，得到重组质粒PG18-VP2。利用脂质体转染法将重组转移质粒PG18-VP2与猪PRV弱毒株DNA共转染猪睾丸细胞，以EGFP荧光标记，通过5轮蚀斑筛选纯化，成功获得表达PPV VP2蛋白和猪IL-18且带EGFP标记的重组伪狂犬病病毒IL18-VP2-rPRV。用重组病毒感染ST细胞，12 h后在荧光显微镜下可见明亮的绿色荧光，通过RT-PCR证实感染细胞中含有PPV VP2和猪IL-18 mRNA，Western-blot试验结果显示，重组病毒能表达具有生物活性的PPV VP2蛋白和猪IL-18。重组病毒经连续20次传代后感染细胞仍能发出绿色荧光，PCR检测表明VP2及IL-18基因在重组病毒中能稳定遗传。为进一步研究表达PPV VP2蛋白和猪IL-18的重组猪伪狂犬病病毒的免疫效力奠定了基础。

2.3 病毒样颗粒疫苗

病毒样颗粒又称伪病毒或假病毒，是由病毒的一个或多个结构蛋白自动组装而成的空心颗粒，外形与天然病毒粒子相似，不含病毒核酸，不能复制，具有很强的免疫原性，可作为免疫源，安全性好，无感染性，能诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应，是研制安全高效的预防病毒病的潜在候选疫苗。Martínez等[26]将PPV VP2基因克隆到杆状病毒系统中，并成功地在昆虫细胞中高效表达，表明VP2多肽能够自我装配成VLPs，该研究为PPV新型亚单位疫苗的研究提供了新思路，而且PPV VLPs不仅自身可以作为疫苗，在外源多肽的转运及多价疫苗的研制中也发挥重要作用。Antonis等[27]用昆虫细胞中表达的PPV VP2基因产物制备VLPs疫苗，在添加免疫佐剂的情况下，VLPs疫苗可在猪体内产生高滴度的血清抗体。潘群兴等[28]将O型口蹄疫病毒（FMDV）VP1中编码T细胞表位肽（aa 21-aa 40）序列连接于PPV VP2的5'端，并插入到杆状病毒供体质粒pFastBac HTA中，构建成重组转座载体pFastBac-FMDV-VP1-PPV-VP2，转化含有穿梭载体Bacmid的E.coli DH10Bac中，经蓝白菌落筛选获得重组杆状病毒表达质粒rBac-FMDV-VP1-PPVVP2，转染昆虫草地夜蛾（Sf9）细胞，并在Sf9中进行了表达。电镜观察显示，表达的重组蛋白能够自我组装成病毒样颗粒，小鼠免疫试验证实，在低浓度FMDV抗原下能够产生特异性T淋巴细胞增殖反应，而且该病毒样颗粒能诱导机体产生抗FMDV特异性细胞免疫反应。徐志文等[29]以pEGFP-C1为载体构建了含有PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因的重组质粒pEGFP-VP2.ORF2，经转染及电镜观察表明成功获得VP2.ORF2重组病毒样颗粒。重组病毒样颗粒经超速离心纯化后免疫小鼠，同时设立PPV普通疫苗组、PCV2弱毒株组及空白对照组，并在不同时期检测小鼠CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞动态变化情况及PPV和PCV2抗体水平。结果显示：VP2. ORF2重组病毒样颗粒免疫小鼠后能诱导较高水平的细胞免疫和高于同等条件普通疫苗和弱毒株的体液免疫水平。陈杨等[30]利用PCR技术从PPV SC1株基因组中扩增VP2全基因，并将其插入真核表达载体pPI-2.EG-FP中，构建转移载体pPI-2.EGFP. VP2。采用脂质体介导法将PRV SA215株DNA与pPI-2.EGFP.VP2 DNA共转染Vero细胞，待出现细胞病变后收集病毒液。经空斑纯化，并同时采用检测PPV VP2基因的PCR方法筛选获得重组病毒PRV SA215/VP2株。以兔抗VP2的多克隆抗体建立的免疫荧光技术可检测到Vero细胞发出的特异性荧光，表明PPV VP2成功插入到PRV SA215基因组中，并获得表达。进一步电镜观察表明，感染PRVSA215/VP2的Vero细胞中可同时观察到PRV与PPV 2种病毒样颗粒。结果表明，成功实现了利用PRV载体表达PPV VP2蛋白病毒样颗粒，为进一步研制PPV病毒样颗粒疫苗奠定了基础。

3 小结

PPV是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，广泛存在于世界各养猪场，造成的经济损失十分严重，因此，做好猪细小病毒病防控的研究相关工作非常重要。目前已经建立了PPV多种分子生物检测方法，如常规PCR方法、多重PCR方法、荧光定量PCR方法、环介导等温扩增技术、基因芯片等，但这些方法各有利弊，有时需将几种检测方法结合起来，综合判断，才能得到准确的检测结果。当前对猪细小病毒病的防控主要靠接种疫苗，传统的灭活疫苗存在需要量大，作用时间短，需多次注射等缺点，弱毒株不易于储存和运输，且存在毒力返强的危险。近年来，PPV新型疫苗研制已取得了很大的进展，研制了一系列新型疫苗，如核酸疫苗、活载体疫苗，但核酸疫苗可能与宿主基因发生整介诱发癌变等，活病毒载体疫苗制备技术复杂，主要停留实验室阶段，并没有大规模推广应用实际生产中，病毒样颗粒疫苗具有高效的免疫原性，而且不存在散毒和基因重组的威胁，给PPV的免疫防控带来了新的希望，成为各国研究的焦点。相信在不久的将来随着病毒分子生物学的发展及对PPV蛋白功能研究的深入，必将研制出安全、高效、廉价、易于保存和运输的新型基因工程疫苗。

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（编辑：郭玉翠）

S858.28

A

1002-1957(2016)03-0125-04

2015-12-09

山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目（SDAIT-06-022-15）；山东省自然科学基金项目（ZR2013CQ006）；山东省自然科学基金青年基金项目（ZR2014CQ010）

李天芝（1985-），女，山东菏泽人，助理研究员，硕士，主要从事动物传染病诊断研究.E-mail：517493935@qq.com