软骨形成因子及骨生成因子在骨重塑中的作用*

王直兵 综述，张　峡，张　瑗，程兴旺，郝　勇，张玉梅，周　跃 审校

(第三军医大学新桥医院骨科，重庆　400037)



·综述·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.043

软骨形成因子及骨生成因子在骨重塑中的作用*

王直兵 综述，张峡△，张瑗，程兴旺，郝勇，张玉梅，周跃 审校

(第三军医大学新桥医院骨科，重庆400037)

Sox-9； RunX-2； 软骨； 软骨下骨

软骨损伤会引起软骨下骨改变，然损伤后修复，对骨科医师来讲，一直是个难题。因软骨无血管，只有软骨细胞，损伤后其自身修复能力非常有限。目前，许多方法的治疗效果均不理想。目前，学术界普遍认为软骨全层损伤会引起骨关节炎，最终执行关节置换[1]。近年来，许多学者发现，在性别的分化、胚胎的发育、骨骼及神经系统发育的过程中，SOX基因家族起着至关重要的作用。有研究揭示在胚胎的软骨生发区，sry相关高迁移率蛋白转录因子(Sry-related high-mobility-group box transcription factor，Sox-9)的表达很高，并影响Ⅱ型胶原(COLⅡ)的合成，对软骨生成产生作用[2]。 与此同时，runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RunX-2)在成骨及软骨细胞的分化、成熟、基质蛋白生成方面都有着重要的作用。该综述针对软骨诱导生成蛋白Sox-9和骨诱导生成蛋白RunX-2对软骨损伤后，软骨下骨的重塑作用作一总结。

1　Sox-9分子的生物学特征

1.1Sox基因家族近年来，许多学者发现SOX基因家族，在性别的分化、胚胎的发育、骨骼及神经系统发育的过程中，起着至关重要的作用。近年对Sox-9基因的研究一直是个热点。在人类17号染色体，Sox-9位于其长臂，HMG-box保守基因为其主要特征，该基因能与DNA序列特异性结合。许多研究证实，SOX 转录因子具有维持软骨细胞表型的重要作用[3-4]。当今，许多学者认为除了肥大软骨细胞，在肌肉骨骼系统发育过程中，Sox-9几乎表达于所有软骨细胞[4]。

1.2软骨细胞与Sox-9的关系体外实验发现，Sox-9能结合特定软骨基质蛋白，并将其激活，例如COL2A1等胶原蛋白以及糖胺聚糖等[3-4]。Sox-9部分结合COL2A1编码序列，说明Sox-9对COL2A1表达进行调控。部分研究者认为，Sox-9功能上调控软骨的发生，然而其具体机制仍不清楚。有文献揭示，软骨祖细胞的增殖、募集、成熟以及肥大后的转化，都与Sox-9的表达相关。但当Sox-9基因停止表达后，相应的软骨特异性分子(如胶原蛋白及糖胺聚糖)也停止表达，但在缺失Sox-9基因的小鼠身上却表现出发育不全的弯肢[5]。Sox-9是调节软骨分化发育的重要转录蛋白，在软骨细胞膜表面存在aggrecan蛋白增强蛋白COLⅡ，Sox-9与其结合并使之激活、表达，进一步调节软骨分化。有研究发现，在非软骨细胞内存在软骨基因，在该基因上存在增强子序列，Sox- 9能与之结合并使其激活，导致非软骨细胞产生软骨细胞样表型[4]。Kim等[6]及其研究团队将聚(乳酸-羟基乙酸)纳米微球用活化后的PEI/ Sox-9基因转染入骨髓间充质干细胞，不管是体内还是体外实验均显示Ⅱ型胶原、Aggrecan、COMP基因的表达上调，同时糖胺聚糖的合成也增加，利用阿利辛蓝、番红-固绿染色也证实，通过非病毒Sox-9基因转染至软骨细胞也能成功控制软骨的分化。陈金武等[7]将Sox-9基因以脂质体形式成功转入胎儿骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)，转染后的第2、16天时，他们发现标签蛋白Flag以及过表达的Sox-9使BMSCs发生软骨细胞分化，软骨特异性蛋白COLⅡ的表达也增加，并证实标签蛋白Flag由Sox-9表达。徐忠世等[8]也做了类似研究，他们将成功转染Sox-9基因后的BMSCs，种植于支架PLGA内，在体外共培养后，移植入软骨缺损后的动物模型身上，HE染色显示：在第12周时，缺损的软骨区域出现大量成熟的软骨细胞，大量的软骨基质及胶原纤维在胞质内出现，类似于正常软骨。这些都表明对种子细胞行Sox-9基因的转染，可以成功实现损伤软骨的修复。

综上可以得出，Sox-9参与骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化的调控，对软骨祖细胞增殖、募集、成熟及其肥大转化发挥着至关重要的作用，控制软骨特异性细胞外基质的表达，是软骨形成、修复重建的主要调控者。

2　RunX-2分子构成与特性

RunX-2属于runt结构域，为RunX家族转录因子。因N-端序列不同，RunX-2有3种异构形式[9]，按起始氨基酸序列的不同分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，Ⅰ型为MRIPVD，Ⅱ型为MASNSL，Ⅲ型为MLHSPH。每种异构体都被两种转录启动子Pl和P2调控，同时还具有NF-KB、AP-l、c-Myb和HLH等多种其他转录因子结合位点。研究显示，即使RunX-2只存在1个完整的成骨基因结合位点，CBFcd蛋白的过表达也能对其发挥反馈性抑制作用[10]。这个现象说明在CBFcd的表达过程中，CBFcd蛋白自身结合位点及成骨基因的存在是其负反馈调控的关键。该机制是成骨细胞调节分化过程中的重要环节，如果没有CBFcd蛋白自身紧密及严格的负反馈调节机制，成骨细胞分化过程中精确的生物学功能调控根本没办法完成。

3　Run-2参与的骨代谢

3.1RunX-2与成骨细胞的关系研究显示，被敲除RunX-2基因的小鼠均失去了膜内及软骨内成骨能力，这一研究表明，在成骨细胞的分化过程中RunX-2基因具有极其重要的作用[11]。即使存在基质金属蛋白酶2(bone morphogenetic protein,BMP2)，缺失RunX-2基因的小鼠颅骨细胞，无论体内还是体外均失去了分化为成骨细胞的能力，但却保留了向脂肪细胞及软骨细胞分化的潜力。因此可以看出，缺失RunX-2基因的BMSCs虽然丧失了向成骨细胞分化的能力，但仍具有向脂肪细胞及软骨细胞分化的能力[12]。RunX-2基因在早期时能促进MSCs分化为成骨细胞，Gersbach等[13]通过转基因的技术成功使RunX-2在原代成肌细胞中稳定表达，成肌细胞获得典型的成骨作用，骨基质生成相关基因的表达明显增加，碱性磷酸酶(alkaline phospha-tase，ALP)分泌显著增加，并出现基质矿化。研究显示，首先将BMLB/c小鼠颅骨造成5mm的缺损，MSCs转导Ad-Cbhl/osf2后种植于缺损区域，在体内观察Cbfαl/Runx-2诱导骨形成，4周后，发现85%的缺损区域出现骨性愈合，在对照实验组却没有发现骨愈合[14]。有文献显示，在体外，RunX-2过表达的成骨细胞不仅不会使骨形成增加，相反还会加速破骨细胞分化，破骨细胞分化因子的表达增加，促进骨的吸收[15-17]。

3.2软骨细胞与RunX-2基因RunX-2的表达随软骨细胞的成熟逐渐增加，在肥大软骨细胞内，RunX-2基因大量表达，与COLⅡ的表达呈正相关。体外实验显示，RunX-2基因敲除后，小鼠软骨细胞的分化被抑制，只有少部分骨骼内发现X型胶原表达，出现成脂分化[18-20]。在转基因小鼠体内，因RunX-2基因的过表达，出现软骨细胞早熟，骨化加速；在未成熟软骨细胞内，RunX-2基因的连续表达能诱使非成熟软骨细胞的肥大[11，21]。这些表明，软骨细胞的成熟及其分化与RunX-2基因密不可分；此外，有研究表明，RunX-2基因还参与血管长入，基因缺失后，血管入侵的能力明显下降[22]。将转入小鼠体内后，肥大软骨细胞募集不能，该现象表明通过调节终末肥大软骨细胞中的基质蛋白相关基因，加速软骨细胞的终末期分化，能加快软骨的血管长入过程以及软骨细胞分化为终末细胞[23-24]。

3.3RunX-2对细胞外基质的调节研究显示，在成骨分化相关基因骨钙蛋白基因的启动子中具有2个成骨细胞特定元素(osteoldast specific elements，OSE)序列，该序列为RunX-2结合位点。骨桥接素、ALP(alkaline phospha-tase)、骨涎蛋白和Ⅰ型胶原等其他成骨分化相关基因的启动子中也存在OSE。由此，RunX-2与启动子中的OSE序列结合后，可有效促进骨细胞外基质的合成，包括Ⅰ型胶原、骨保护素、骨唾蛋白、骨钙素等[25-26]。

以上诸多研究显示，RunX-2基因不仅能使原代成肌样细胞分化为具有矿化能力的成骨样细胞表型，还能促进MSCs向成骨细胞系分化；与此相同，Inman等[27]研究也显示，在早期Runx-2能促进成骨细胞分化，可是，在晚期却为抑制成骨细胞分化。而且，在软骨细胞向终末细胞的分化过程及胞外基质形成方面，Runx-2都表现出极其重要的作用，充分揭露了Runx-2基因在损伤软骨和软骨下骨修复过程中的重要地位。

4　展　望

在软骨细胞内，Sox-9的表达在软骨祖细胞的增殖、募集成熟以及向肥大软骨细胞的转化方面起着至关重要的作用，对软骨的发生，损伤后修复、重建起主要调控；RunX-2基因不仅能促进成骨细胞的分化及骨形成，加速软骨细胞的分化成熟及后期血管化，还参与破骨细胞分化、成熟及其细胞外基质生成，这些都有力地说明了在软骨与软骨下骨的修复重建中，Sox-9和RunX-2有着极其重要的作用。

鉴于此，如果能在基因工程技术中，充分发挥该两种基因的作用，在不久的将来有望实现软骨及软骨下骨损伤后的修复。

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国家自然科学基金面上项目(81171720)。作者简介：王直兵(1985-)，主治医师，硕士，主要从事骨关节损伤与修复的研究。△

，E-mail:wangzhiqiang18716@126.com。

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1671-8348(2016)27-3865-03

2016-02-18

2016-04-06)