茶叶咖啡碱的研究进展

陈宇宏，王 振，文 祎，黄建安，刘硕谦，刘仲华

（湖南农业大学 茶学教育部重点实验室，国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南省植物功能成分利用协同创新中心，湖南 长沙 410128）

茶叶咖啡碱的研究进展

陈宇宏，王 振，文 祎，黄建安，刘硕谦*，刘仲华*

（湖南农业大学 茶学教育部重点实验室，国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南省植物功能成分利用协同创新中心，湖南 长沙 410128）

从咖啡碱的生物合成、分解代谢、提取纯化、分析检测和生物活性五个方面进行了综述。

咖啡碱；生物合成；代谢；生物活性

咖啡碱是一种无色针状结晶的含氮化学物，略带苦味，分子式为C8H10N4O2。茶叶中咖啡碱的含量通常在3%～5%，随茶树生长发育条件及品种不同而有所差别，一般芽中含量最高。咖啡碱也是茶叶的重要滋味物质，对品质有较大的影响，且其含量高低与茶叶品质成正相关，品质越好，内含咖啡碱的含量一般越高。

1　咖啡碱的生物合成

咖啡碱的生物合成过程中，一是需要嘌呤环的来源，二是需要甲基供体。关于咖啡碱的合成途径大多是通过对咖啡果和茶树的研究得来的。咖啡碱的嘌呤环骨架来源于嘌呤核苷酸，Ashihara和Suzuki［1］在大量研究基础上，将咖啡碱的合成途径分成了两个部分：核心途径和供体途径。

1.1核心途径

咖啡碱的生物合成核心途径是以黄嘌呤核苷作为起始底物，并经过三步甲基化和一步核苷降解反应而最终合成。Suzuki等［2］指出在茶树和咖啡树中，咖啡碱是由黄嘌呤核苷（Xanthosine）→7-甲基黄嘌呤核苷（7- methyl xanthine nucleotide）→7-甲基黄嘌呤（7- methyl xanthine ）→3、7-二甲基黄嘌呤核苷（3， 7-two methyl xanthine ）（俗称可可碱）→1、3、7-三甲基黄嘌呤核苷（1， 3， 7- three methyl xanthine）（俗称咖啡碱）路径合成。Ashihara 等［8］在咖啡树叶片中利用同位素示踪实验证明了这条路径。Negishi等［3］从茶树叶片中获得7-NMT （Xanthosine methyltransferase/7-methylxanthosinesynthase，黄嘌呤核苷N-甲基转移酶），其被证实是催化黄嘌呤核苷转化成7-甲基黄嘌呤核苷的酶。Mizuno等［4］克隆了该酶全长基因CmXRS1，并验证出其有N-甲基转移酶活性。Kato［5］等从茶树嫩叶中获得了TCS（tea caffeine synthase，茶树咖啡碱合成酶），催化咖啡碱合成的最后两步反应，对1，7-二甲基黄嘌呤、7-甲基黄嘌呤和可可碱都显示了高催化活性。随后Kato等［6］克隆出该酶的编码cDNA，TCS1，其主要催化嘌呤环的3位和1位N-甲基化。

1.2供体途径

在供体途径中，有多种来源可以最终合成黄嘌呤核苷，从而为核心途径提供起始甲基受体。目前已发现至少4条路径：腺嘌呤核苷酸路线［7］、鸟嘌呤核苷酸路线［2］、嘌呤环从头合成路线［8］和S-腺苷甲硫氨酸循环路线［9］，其中腺嘌呤核苷酸路线是最重要的途径。冯艳飞等［10］首次克隆得到SAM（S-adenosyl methionine，茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶）基因cDNA，其预测氨基酸序列与其他物种的SAM合成酶有超过90%的同源性，SAM在S-腺苷甲硫氨酸循环路线中起重要的作用，且茶树中黄嘌呤核苷主要来源于此循环途径。IMPDH（Inosine monophosphate dehydrogenase，次黄嘌呤核苷酸脱氢酶）是催化IMP转化为XMP的关键酶，Keya等［11］首次克隆得到IMPDH基因编码cDNA，TIDH （EU106658），并证明其在咖啡碱合成途径中起关键作用。

1.3茶树中咖啡碱非主要合成途径

在茶树中另有其余非主要途径，如补救途径是茶叶碱通过3-甲基黄嘌呤、可可碱而最终合成咖啡碱［7］。Kato 等［12］在探究茶树嫩叶中N-甲基转移酶的活性后，提出了另一种非主要路径，即7-甲基黄嘌呤→1、7-二甲基黄嘌呤（拟黄嘌呤）→咖啡碱。

2　咖啡碱的分解代谢

咖啡碱产生于嫩叶和未成熟的果实中，并在这些器官的成熟过程中逐渐积累，在这之间咖啡碱会逐渐降解三甲基，从而最终形成黄嘌呤。在咖啡叶中咖啡碱代谢首先由Kalberer［13］报道。自那时以来，若干使用的14C嘌呤生物碱示踪实验已经被报道［14-18］，表明主要的分解代谢途径是咖啡碱→茶叶碱→3-甲基黄嘌呤→黄嘌呤。黄嘌呤随后进入传统的嘌呤降解途径，首先在黄嘌呤氧化酶的作用下，氧化成尿酸，它的进一步分解因不同种类的生物体内有关分解酶是否存在而异。人和动物体内分解尿酸的能力较低，常以尿酸为最终产物。而植物体内因广泛地存在着尿囊素酶、尿囊酸酶和尿酶等一系列酶，因此能继续分解尿酸，并最终分解成氨和二氧化碳。咖啡碱降解为茶叶碱是整个降解过程的限速步骤［6，19-20］。

3　咖啡碱的提取纯化

在早期的研究中，提取咖啡碱的方法已有多种，如溶剂法、升华法、离子沉淀法、柱层析法、超临界CO2法和微波萃取法。近年来，人们将提取咖啡碱的方法不断优化。尹志芳等［21］采取超临界CO2萃取技术提取益阳黑茶中的咖啡碱，通过正交实验获得咖啡碱的最佳萃取条件为：萃取温度40℃，萃取压力20 MPa，固定萃取时间2 h，夹带剂采用体积分数为70%的乙醇，适宜用量为300 mL/150 g，咖啡碱产率为（0.457±0.036）%。王立升等［22］用福建乌龙茶为原料，以超声-微波协同萃取法为实验方法，探讨了提取咖啡碱的最优条件。结果表明，在微波功率500 W、加热时间4 min、乙醇浓度90%、提取温度90℃、料液比1∶20 g/mL时为最优条件。在此条件下，咖啡碱产率2.60%，纯度（94±0.4）%。李振武［23］采用二级树脂吸附层析法对茶多酚与咖啡碱进行分离与纯化，通过对离子交换树脂及大孔吸附树脂进行筛选，最终选定NKA-Ⅱ树脂作为第二级吸附树脂用于咖啡碱的回收，回收的咖啡碱副产品的纯度为46.5%，若将此咖啡碱进行二次升华后，其纯度可达97.5%。周顺珍等［24］以GB/T8313-1987水浸出方式作为样品的提取方法对7种儿茶素组分及咖啡碱进行HPLC测定，对比国家标准GB/T8313-2008提取样品，此操作更简单、方便，且效率高。

4　咖啡碱的分析检测

除常规的实验室定量检测咖啡碱的方法如碘量法、比色法、定氮法、紫外分光光度法等外，近年来，因为色谱法灵敏度高，操作简便，检测结果准确，被广泛应用于咖啡碱的含量检测中［25］。许祯毅［26］对采用HPLC测定武夷岩茶中咖啡碱含量的影响因素和条件进行探讨，结果表明茶叶样品中咖啡碱含量与峰面积在标准曲线范围内线性良好，且在MgO添加量为0.5 g、沸水浴中浸提时间为30 min时，测得咖啡碱含量的相对标准偏差为0.63%，加标回收率为92%～102%，此方法能应用于不同武夷岩茶品种中咖啡碱的检测。张琪等［27］用等度洗脱法对茶叶中6种儿茶素及限量成分咖啡碱的HPLC定量测定，结果显示此方法简单、准确、重现性好。褚利平等［28］建立了红茶中咖啡因含量的HPLC测定方法，并表示用此方法可鉴别药材真伪，并控制药材质量。郭颖等［29］利用UPLC对咖啡碱的含量进行了分析，并表示此方法相较HPLC的分析时间大大缩短，仅需6 min。另外，宋爽等［30］用低pH沉淀法检测了茶叶中的结合咖啡碱，结果显示普洱茶（熟茶）水提物中的结合咖啡碱含量最高，而绿茶和红茶水提物中只有极少量的咖啡碱为结合态。

5　咖啡碱的生物活性

5.1抗癌与治疗肿瘤

在人们发现咖啡碱与癌症、肿瘤的关系之前，咖啡碱因能兴奋中枢神经系统而被应用于抗疲劳、抗焦虑等症状中［31-32］。至今国内外已有许多报道证实，咖啡碱的摄入量对于癌症及肿瘤有一定的防治作用。Hildebrand等［33］在26年间对968432人的随访结果进行分析，结果发现，相对于不喝或偶尔喝咖啡的人，每天喝含咖啡碱的咖啡多于4杯的人，口咽癌死亡风险降低49%，这表明咖啡碱的摄入量与口咽癌死亡率呈负相关。李越等［34］以86例子宫内膜癌患者作为研究对象，对比了辅以咖啡碱治疗的患者与不辅以咖啡碱治疗的患者在经过紫杉醇联合顺铂二联化疗方法治疗后的子宫内膜组织雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）及p21的蛋白表达水平，以及血清CA -125水平，发现辅以咖啡碱治疗的患者的这些指标增加更明显。范耀东［35］观察了以不同浓度和作用时间的咖啡碱对U251神经胶质瘤细胞的作用，初步证明了咖啡碱在体外可以抑制U251人胶质瘤细胞的增殖活性并在一定浓度范围内（1～10 mM）可促使其凋亡。

5.2防治阿尔茨海默病

咖啡碱对于大脑皮层的兴奋作用尤为显著，有研究发现其对于阿尔茨海默病等神经疾病存在潜在的预防作用［36］。Maia 等［37］通过对实例的分析，利用回归分析方法，表示在一定范围内，咖啡碱摄入量高低与患阿尔茨海默病的风险有显著的负相关。Santos 等［38］在2005年至2008年间对1999年至2003年间招募的648人的随访中发现，咖啡碱与女性认知能力下降之间呈负相关，但对于男性没有明显关系。Dall'lgna等［39］提供了第一个体外证据，表明腺苷A2A受体可以作为一个指标，证明摄入咖啡碱能有益于阿尔茨海默病的治疗。研究显示［40］：每天适当摄入咖啡碱可能延迟阿尔茨海默病的发生或降低患阿尔茨海默病的风险。

5.3防治帕金森病

大多数研究表明，咖啡碱与帕金森病呈负相关，且此关系对性别无明显差异［41］，并有结果表明，咖啡碱对帕金森病患者有一定的保护作用［42］，当咖啡摄入量约为每天3杯时，其保护作用达到最大值。

5.4治疗早产儿原发性呼吸暂停

咖啡碱是呼吸系统的刺激药物，是治疗早产儿呼吸暂停的常用手段之一［43］。王晓敏等［44］以42例早产儿原发性呼吸暂停患儿为观察对象，在给予枸橼酸咖啡因规范治疗后，发现患儿呼吸暂停平均每天发作次数明显减少、严重程度降低。魏彦敏等［45］探讨了咖啡因联合药物治疗超低出生体质量儿呼吸暂停的最佳剂量，低剂量组（5 mg/kg）治疗效果略高于高剂量组（8mg/kg）治疗效果，且减少了大剂量使用所致的不良反应事件的发生。但也有研究显示，枸橼酸咖啡因在使用期间会导致机体的耗氧量增加、患儿体重增长减慢，提示在应用该药时需适当增加患儿的热量摄入［46］。

6　结语

咖啡碱在茶树体内核心途经和供体途径中参与酶的合成以及调控作用已基本明晰。然而，咖啡碱的合成并非只受咖啡碱合成酶控制，在整个咖啡碱的合成代谢途径中，任何一种酶都有可能对可可碱、咖啡碱等嘌呤碱的含量产生影响。即便获得足够多的遗传信息，在技术不成熟的茶树遗传化领域还有很多问题需要解决。

茶树体内的咖啡碱代谢途径是复杂而且多样化的，未来可以更多的发掘咖啡碱合成与分解代谢途径酶基因信息，为之后的茶树新品种选育特别是低咖啡碱茶树品种选育奠定良好的基础。

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Research Progress on Caffeine

CHEN Yu-hong，WANG Zhen，WEN Yi，HUANG Jian-an，LIU Shuo-qian*，LIU Zhong-hua*
（Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education， Hunan Agricultural University， National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals， Hunan Co-Innovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients，Changsha 410128， China）

This paper reviewed the progresses in the caffeine biosynthesis， catabolism of caffeine， caffeine extraction and purifcation， caffeine and caffeine analysis and detection of biological activity.

Caffeine， Biosynthesis， Metabolism， Biological Activity

S571.1

A

1009-525X（2016）03-03-07

2016-05-17

2016-06-14

陈宇宏（1992-），女，湖南长沙人，在读硕士研究生，研究方向：茶叶功能成分化学。

刘硕谦，shqianliu@sina.com；刘仲华，Larkin-liu@163.com