益景汤对糖尿病大鼠心脏血流动力学指标和心肌细胞凋亡的影响*

赵　利　郑　直　刘光辉　王　丽　陈　丰　翁锦龙　石　洪　林梦龙



益景汤对糖尿病大鼠心脏血流动力学指标和心肌细胞凋亡的影响*

赵利郑直刘光辉王丽陈丰翁锦龙石洪林梦龙

【摘要】目的：观察益景汤对糖尿病(DM)大鼠心脏血流动力学、心肌肥大和心肌细胞凋亡的影响。方法：采用链脲佐菌素(STZ)成功诱导DM大鼠模型，将成模大鼠分为益景汤治疗组(每天汤药灌胃3ml，相当于生药10.71g/kg)、贝那普利治疗组(每天腹腔注射10μg/kg)、模型组(每天给予3ml生理盐水灌胃)，每组20只，另选20只为正常组(每天灌胃3ml生理盐水)。连续12周后采用动脉插管测定心脏血流动力学指标左室压力(LVP)、左室内压最大上升/下降速率(+dp/dtmax和-dp/dtmax)及左室舒张末压(LVEDP)。之后称取大鼠体重(BW)，并取各组大鼠心脏称重(HW)，再取左室称重(LVH)，计算心脏质量指数(HMI)和左室质量指数(LVMI)；切取部分左室制备心肌组织切片，采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡。结果：方差分析显示，各组大鼠心脏血流动力学指标及HMI和LVMI均有统计学差异(P均<0.01)。两两比较表明，DM各组LVP、+dp/dtmax及-dp/dtmax均低于正常组，且模型组<益景汤治疗组<贝那普利治疗组，差异均有统计学意义(P均<0.01)；DM各组LVEDP 均高于正常组，且模型组>益景汤治疗组>贝那普利治疗组，差异也有统计学意义(P均<0.01)；DM各组HMI和LVMI均明显高于正常组(P<0.01)，但益景汤治疗组与模型组之间无统计学差异(P>0.05)；DM大鼠治疗组较模型组心肌细胞的凋亡程度轻，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：DM大鼠在第12周已经出现心肌凋亡，益景汤能改善DM大鼠心脏血流动力学，抑制心肌细胞凋亡。

【关键词】益景汤；糖尿病心肌病；血流动力学；心肌细胞；凋亡；大鼠

糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者发生心力衰竭比例显著高于非糖尿病患者的原因之一。国外研究显示DCM的发生率为0．76%[1]。心脏肥大和功能障碍是DCM的重要临床表现，心肌细胞凋亡在DCM发生、发展过程中起一定作用[2]。我们的前期研究证实加味补阳还五汤，即本次研究所用益景汤对DCM相关病理指标有改善作用[3]，本文观察益景汤对DM大鼠心脏血流动力学指标和心肌细胞凋亡的影响。

1材料和方法

1.1实验动物

6周龄健康雄性清洁级SD大鼠86只，体重(250±20)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。

1.2主要药物、试剂与仪器

益景汤(生黄芪15g、山药15g、苍术9g、桃仁5g、红花5g、当归9g、川芎6g、赤芍10g、茯苓15g、生地15g、玄参15g，放入200ml自来水中文火煎至汤汁约50ml时纱布过滤备用。由本院药剂科完成)。贝那普利注射液(洛汀新，瑞士诺华公司)；链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司，货号S0087 )；TUNEL试剂盒(美国Sigma公司，货号G6980 )；血糖(BG)测定试剂盒(北京拜尔迪生物技术有限公司，货号EBGL-200)。压力换能器(YP100，河南郑州)，BL-420生物信号采集与处理系统(河南郑州)，生物光学显微镜(奥林巴斯CX22型)，血糖仪(One Touch UltraVue,美国Johnson公司)。

1.3实验方法

1.3.1DM模型制备及分组：86只SD大鼠，20只作为正常组，余66只复制DM模型：适应性喂养1周，禁食12h后，一次性腹腔注射STZ(60mg/kg)诱发DM。STZ临用前以0.1mmol/L、pH4.5柠檬酸缓冲液溶解，配制成1%溶液。于腹腔注射前及注射后72h取尾血检测每只大鼠BG，其值≥16.7mmol/L者即为DM大鼠[4]。本次造模过程中6只大鼠意外死亡。60只成模大鼠随机分为模型组、益景汤组、贝那普利治疗组，每组各20只。

1.3.2各组大鼠给药、处理：从大鼠成模当天开始给药或处理，持续12周。益景汤治疗组采用益景汤灌胃，按临床方剂每日剂量10.71g/kg计算，取益景汤1.35ml，加蒸馏水稀释至3ml，一次性灌胃，每日1次。贝那普利治疗组大鼠腹腔内注射贝那普利10mg/kg，每日1次；正常组、模型组给予等量生理盐水3ml灌胃，每日1次；各组用药或其它处理12周，期间均行常规饲养，并每周测1次BG和观察记录一般状况。

1.3.3血流动力学指标测定：干预12周后，各组大鼠以20%乌拉西坦(0.5ml/kg)静脉泵入麻醉后，颈动脉插管连接压力换能器，经左颈总动脉插管至左心室腔内，通过压力换能器描记左心室压力(Left Ventricular Pressure，LVP)曲线，通过BL-420生物信号获取与处理系统采集LVP电信号，分别测定左心室内压最大上升速率(Maximum Rate of Rise of LVP，+dp/dtmax)和最大下降速率(Maximum Rate of Decrease of LVP，-dp/dtmax)以及左心室舒张末压(Left Ventricular end Diastolic Pressure,LVEDP)。连续测量10个心动周期，取均值。

1.3.4心肌肥厚和心肌细胞凋亡检测：测定心脏血流动力学指标后断颈处死各组大鼠，迅速称取体重(BW)后取出心脏，用冷等渗盐水洗净,滤纸吸干,称取并记录心脏重量 (HW，g)及左心室重量(LVH，mg)，计算心脏质量指数(HMI=HW/BW)及左心室质量指数(LVMI=LVH/BW)。然后将心脏标本编号后采用多聚甲醛固定、常规方法脱水、透明、浸蜡、包埋、连续切片(4μm)、展片与粘片后烘干。每只大鼠取10张切片，采用过氧化物酶标法按照TUNEL原位凋亡试剂盒说明书染色步骤操作。高倍镜(×400)下计数目镜方格内10个视野TUNEL阳性细胞数(呈棕褐色)，取均值进行统计学分析。

1.4统计学处理

2结果

2.1各组大鼠血流动力学指标

方差分析显示，各组大鼠LVP、+dp/dtmax、-dp/dtmax和LVEDP差异均有统计学意义(P<0.01)。两两比较结果表明，模型组大鼠LVP、+dp/dtmax及-dp/dtmax较正常组明显下降(t=18.273、13.328、19.009，P均<0.01)，LVEDP明显升高(t=-19.90，P<0.01)；贝那普利组大鼠LVP、+dp/dtmax及-dp/dtmax较正常组大鼠明显下降(t=3.229、6.540、9.466，P均<0.01)，LVEDP明显上升(t=-9.748，P<0.01)，但较模型组LVP、+dp/dtmax及-dp/dtmax明显升高(t=-13.70、-9.446、-13.10，P均<0.01)，LVEDP明显下降(t=10.445，P<0.01)；益景汤治疗组大鼠LVP、+dp/dtmax及-dp/dtmax也低于正常组(t=7.548、10.341、11.265，P均<0.01)，LVEDP也高于正常组(t=-13.20，P<0.01)；但较模型组LVP、+dp/dtmax及-dp/dtmax明显上升(t=13.903、6.361、11.070，P均<0.01)，LVEDP明显下降(t=-8.261，P<0.01)。贝那普利治疗组LVP、+dp/dtmax及-dp/dtmax高于益景汤治疗组(t=-3.110、4.684、-2.582，P<0.01)， LVEDP低于益景汤治疗组(t=2.886，P<0.01)。见表1。

表1　各组大鼠血流动力学指标比较±s，n均=20)

注：与正常组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.01；与益景汤治疗组比较，3)P<0.01

2.2各组大鼠HMI和LVMI

方差分析显示，各组大鼠HMI和LVMI差异存在统计学意义(P<0.01)。两两比较结果表明，模型组大鼠HMI和LVMI明显高于正常组(t=-26.61和-25.31,P<0.01)；益景汤治疗组HMI和LVMI虽明显高于正常组(t=-22.01和-21.31，P<0.01)，但与模型组差异无统计学意义(t=-1.629和-1.75，P>0.05)；贝那普利治疗组大鼠HMI和LVMI亦明显高于正常组(t=-9.115和-9.115，P<0.01)，但明显低于模型组差异有统计学意义(t=14.791和13.723，P<0.01)；贝那普利治疗组HMI和LVMI明显低于益景汤治疗组(t=12.062和11.161，P<0.01)。见表2。

2.3各组大鼠心肌细胞凋亡数

方差分析显示，各组大鼠心肌细胞凋亡数差异存在统计学意义(P<0.01)。与正常组比较，模型组、益景汤治疗组、贝那普利治疗组凋亡细胞数均明显增多(t=-32.90、-54.40、27.80，P<0.01)。与模型组比较，益景汤治疗组和贝那普利组凋亡细胞数均明显减少(t=-7.813、14.991，P<0.01)。与益景汤治疗组比较，贝那普利组凋亡细胞更少(t=12.395，P<0.01)。见表3。

表2　各组大鼠HMI和LVMI比较均=20)

注：与正常组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.01；与益景汤治疗组比较，3)P<0.01

表3　各组大鼠心肌细胞凋亡数比较±s，n均=20)

注：与正常组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.01；与益景汤治疗组比较，3)P<0.01

3讨论

WHO[5]估计,到2025年全世界DM患者可能达到3亿，糖尿病心血管并发症如DCM等引起的死亡占DM总死亡的70%以上，是非DM人群心血管系统疾病发病率和死亡率的2-3倍；DM患者发生心力衰竭的比例也显著高于非DM患者(DCM)是DM严重并发症之一。

DCM在临床上主要以左心室肥厚和舒张功能不全为主要表现，收缩功能障碍随病情进展逐渐加重；病理特征包括心肌细胞肥大、增生及凋亡。心肌细胞凋亡在DCM的发生、发展过程中起一定作用[2]。高糖培养早期大鼠心肌细胞即可凋亡[6，7]。随着不断增加的心肌细胞坏死和凋亡，心室重构进一步加重，逐渐出现心功能失代偿和心脏舒缩功能进一步减退，最终出现心力衰竭[8，9]。即心肌细胞凋亡可能是导致DM心脏功能障碍的重要原因之一[10]。中医治疗DCM注重益气、养阴、化瘀。益景汤为本院使用多年的经验方[13]，由名方“补阳还五汤”化裁而来，方由黄芪、当归、赤芍、川芎、桃仁、红花、生地、玄参等组成，具有补气通络之效。我们的前期临床研究表明，益景汤对DCM有治疗作用[3]。另有研究报道，补阳还五汤可减少缺氧过程中一氧化氮、氧自由基的生成及抑制体外培养大鼠神经元细胞凋亡[11]，对抗缺氧后的炎性反应，抑制缺血后神经元凋亡[12]。

本研究结果显示，(1)与正常组比较，模型组大鼠HMI和LVMI明显增高(P<0.01)，提示DM大鼠存在心肌肥厚，益景汤治疗大鼠HMI和LVMI有所降低，但与模型组差异无统计学意义(P>0.05)，且不及贝那普利对DM大鼠HMI和LVMI的作用(其与模型组差异有统计学意义，P<0.01)。原因可能与药物干预时间不足以及实验样本量不够有关。(2)与正常大鼠比较，DM模型大鼠LVP、-dp/dtmax和+dp/dtmax明显降低，LVEDP明显升高(P<0.01)；与模型组比较，益景汤和贝那普利治疗均可使LVP、-dp/dtmax和+dp/dtmax明显升高，LVEDP明显降低(P<0.01)。提示益景汤对DCM大鼠心功能有改善作用。(3)DM模型大鼠心肌细胞凋亡较正常大鼠明显增加(P<0.01)，益景汤及贝那普利治疗均可减少DM大鼠心肌细胞凋亡(P<0.01)，降低心功能损害。但益景汤通过何种具体信号通路干预DM大鼠心肌细胞凋亡有待进一步研究。

综上所述，STZ实验性DM大鼠成模12周即可出现心脏血流动力学改变、心肌肥厚和心肌细胞凋亡，益景汤虽然不能明显减轻DM大鼠心肌肥大，但能够显著改善DM大鼠心功能，抑制心肌细胞凋亡，对治疗DCM的发展和预防心衰有所禆益。

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赵利(1979-)，男、汉族、医学硕士、主治医师，主要从事中西医结合心血管病研究

参考文献

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3赵榕，赵利，刘光辉. 加味补阳还五汤对糖尿病心肌病患者BNP,CRP,HbA1c的影响[J]. 中国实验方剂学杂志,2013,19(11):311-314.

4潘琳. 实验性糖尿病病理图谱[M].北京:科学出版社,2007：232.

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Effects of Yijing Pill on Cardiac Haemodynamics and Myocardial Apoptosis in Diabetic Rats

ZHAO Li, ZHENG Zhi, LIU Guang-hui, WANG li, CHEN Feng, WENG Jin-long, SHI Hong，LIN Meng-long

The Affiliated People's Hospital of Fujian Traditional Chinese Medicine University，Fuzhou 350004，China

【Abstract】Objective: To explore effects of Yijing pill on cardiac haemodynamics and myocardial apoptosis in diabetic (DM) rat. Method: The model of DM rat was indeced by U-sing streptozotocin and then the DM rats were divided into the Yijing pill treatment group (Daily intragastric administration of 3ml decoction, equivalent to 10.71g/kg crude drug, n=20) , Benner Pury treatment group (Daily intraperitoneal injection of 10ug/kg, n=20) and the model group (Daily intragastric administration of 3ml normal saline, n=20). In addition, another 20 rats were selected as control group, and 3ml normal saline was poured into the stomach every day. The Left Ventricular Pressure (LVP), maximum left ventricular pressure rising and dropping rates (±dp/dt) and Left Ventricular End Diastolic Pressure (LVEDP) was measured by arterial catheterization after feeding for 12 weeks. After weighing the weight of rats, the heart and left ventricle of each group rats was taken out and weighed, and then the Heart Mass Index (HMI) and Left Ventricular Mass Index (LVMI) were calculated. Part of the left ventricle was used to make the myocardial tissue sections and TUNEL method was used to detect the apoptosis of myocardial cells.Results: Analysis of variance showed that there were significant differences in cardiac hemodynamic parameters, HMI and LVMI in all groups (P<0.01). Compared with the normal group, the LVP, +dp/dtmac and -dp/dtmax significantly decreased in all DM groups, and Model group < Yi Jing Tang treatment group < Benner Pury treatment group (all P<0.01). Compared with the normal group, the LVEDP significantly increased in all DM groups, and Model group > YiJing tang treatment group > benner pury treatment group (all P<0.01). Compared with the normal group, the HMI and LVMI was significantly increased in all DM groups (P<0.01), but there was no significant difference between the YiJing tang treatment group and the model group (P>0.05). The apoptosis of myocardial cells in DM rats appeared in twelfth weeks, which in treatment group was lighter than the model group (P<0.05).Conclusion: The myocardial apoptosis has emerged in DM rats in the first 12 weeks, and Yijing pill can inhibit myocardial apoptosis in DM rats.

【Key words】Yijing pill; Diabetic cardiomyopathy; Haemodynamics; Myocardial cell; Apoptosis; Rat

作者简介：本文第一

[中图分类号]R587.1R542.2

[文献标识码]A

[文章编号]1005-1740(2016)01-0006-05

*[基金项目]国家自然科学青年基金(81102619);福建省自然科学基金(2011j01197);福建省卫生厅青年基金(2011-2-33)

[作者单位]福建中医药大学附属人民医院，福州 350004

本文2015-07-16收到，2015-09-09修回