利用SRAP标记分析贵州砂梨资源遗传多样性

黄　伟,鲁　敏,张　起,安华明*

(1 贵州省园艺研究所,贵阳 550006;2 贵州大学 农学院,贵阳 550025)



利用SRAP标记分析贵州砂梨资源遗传多样性

黄伟1,2,鲁敏2,张起2,安华明2*

(1 贵州省园艺研究所,贵阳 550006;2 贵州大学 农学院,贵阳 550025)

摘要:采用SRAP标记技术,对贵州59份砂梨种质的遗传多样性进行分析。结果表明:(1)筛选的15对SRAP引物共扩增出151个位点,其中120个是多态性位点,多态百分率为79.47%。(2)POPGENE分析表明,贵州砂梨资源在物种水平上有效等位基因数(Ne)为1.355 9,Nei’s基因多样性指数(H)为0.216 9,Shannon’s信息指数(I)为0.336 2;在区域品种群水平Ne=1.261 1,H=0.155 5,I=0.235 2,以黔西南地区资源的遗传多样性最高,六盘水市最低。(3)聚类分析显示,在遗传相似系数0.75处,可将59份砂梨资源分为6个组,聚类分析结果具有一定的地理区域特性。研究认为,贵州砂梨种质具有较为丰富的遗传多样性,并表现出明显的地理区域特性;SRAP标记与ISSR标记在揭示贵州砂梨种质遗传多样性上具有高度的一致性,但SRAP标记能在更小的变异范围内揭示更多的遗传信息。

关键词:砂梨;种质资源;遗传多样性;SRAP

梨属于蔷薇科(Rosaceae)梨亚科(Pomoideae)梨属(PyrusL.)植物,全世界约30多个种[1]。通常认为梨属植物的原种(stock species)起源于第三纪中国西部或西南部的山区[2]。贵州位于中国西南部,其雨量充沛、立体气候明显、小气候区域众多等独特的气候和生态条件,为梨树的分布演化提供了多样的生态环境,孕育出了丰富的梨属植物资源,尤其是极为丰富的砂梨(PyruspyrifoliaNakai)资源[3-6]。本课题组前期工作中基于部分品质指标及ISSR标记,已对贵州部分砂梨种质进行了初步的遗传多样性评价[5-6]。但品质指标受环境影响较大,而ISSR作为显性分子标记,其揭示的遗传信息量相对有限。SRAP分子标记技术[7]针对基因外显子中GC含量丰富而启动子、内含子中AT含量丰富的特点来设计引物进行PCR扩增,因不同个体的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性。SRAP技术简便、快速、稳定并具有高频率的共显性,它有效地克服了RAPD技术重复性差、SSR引物开发费时费力以及AFLP技术复杂、成本昂贵等缺点。近年来SRAP技术在果树遗传多样性分析和比较基因组学研究等方面得到广泛应用[8-11],但在梨属植物上的应用还不多。本研究以广泛收集的59份贵州砂梨资源为试验材料,采用SRAP标记对其遗传多样性及亲缘关系进行分析,可与之前ISSR结果相互印证,为进一步促进贵州砂梨种质资源的科学保存与合理利用提供依据。

1材料和方法

1.1材料

59份砂梨种质资源(表1)的收集与保存同文献[6]。材料采自于贵州省梨资源分布较多的县市,采集一年生枝条进行嫁接保存于贵州大学农学院实验农场。

1.2方法

1.2.1SRAP扩增体系优化采用改良CTAB法[12]提取各材料幼嫩叶片基因组DNA,样品质量和浓度的检测参考文献[6]的方法,并将DNA样品稀释至浓度50 ng·μL-1之后用于SRAP扩增。

表1　供试材料的信息

续表1Continued Table 1

编号Code资源名称Name采样地点Origin29安顺箐口梨ASqingkouli安顺市西秀区XixiuDistrict,AnshunCity30福泉葫芦梨FQhululi黔南州福泉市FuquanCity,QiannanPrefecture31威宁-1WN-1毕节地区威宁县WeiningCounty,BijiePrefecture32威宁-2WN-2毕节地区威宁县WeiningCounty,BijiePrefecture33威宁大黄梨WNdahuangli毕节地区威宁县WeiningCounty,BijiePrefecture34威宁-3WN-3毕节地区威宁县WeiningCounty,BijiePrefecture35威宁-4WN-4毕节地区威宁县WeiningCounty,BijiePrefecture36黄平-1HP-1黔东南州黄平县HuangpingCounty,QiandongnanPrefecture37黄平-2HP-2黔东南州黄平县HuangpingCounty,QiandongnanPrefecture38黄平-3HP-3黔东南州黄平县HuangpingCounty,QiandongnanPrefecture39黄平-4HP-4黔东南州黄平县HuangpingCounty,QiandongnanPrefecture40黄平-5HP-5黔东南州黄平县HuangpingCounty,QiandongnanPrefecture41黄平-6HP-6黔东南州黄平县HuangpingCounty,QiandongnanPrefecture42台江-1TJ-1黔东南州台江县TaijiangCounty,QiandongnanPrefecture43仁怀-1RH-1遵义仁怀市RenhuaiCounty,ZunyiCity44仁怀-2RH-2遵义仁怀市RenhuaiCounty,ZunyiCity45仁怀-3RH-3遵义仁怀市RenhuaiCounty,ZunyiCity46仁怀-4RH-4遵义仁怀市RenhuaiCounty,ZunyiCity47仁怀-5RH-5遵义仁怀市RenhuaiCounty,ZunyiCity48荔波-6LB-6黔南州荔波县LiboCounty,QiannanPrefecture49荔波-1LB-1黔南州荔波县LiboCounty,QiannanPrefecture50荔波-2LB-2黔南州荔波县LiboCounty,QiannanPrefecture51荔波-3LB-3黔南州荔波县LiboCounty,QiannanPrefecture52荔波-4LB-4黔南州荔波县LiboCounty,QiannanPrefecture53荔波-5LB-5黔南州荔波县LiboCounty,QiannanPrefecture54印江-1YJ-1铜仁地区印江县YinjiangCounty,TongrenPrefecture55印江-2YJ-2铜仁地区印江县YinjiangCounty,TongrenPrefecture56印江-3YJ-3铜仁地区印江县YinjiangCounty,TongrenPrefecture57印江-4YJ-4铜仁地区印江县YinjiangCounty,TongrenPrefecture58赫章-1HZ-1毕节地区赫章县HezhangCounty,BijiePrefecture59野生砂梨Pyruspyrifolia黔西南州兴义市XingyiCity,QianxinanPrefecture

采用单因素试验设计梯度进行SRAP体系优化,将2×HotMaster PCR Master Mix(北京天根生化科技有限公司,其中包含 20 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.3,100 mmol·L-1KCl,3 mmol·L-1MgCl2,500 μmol·L-1dNTP,0.1 U·μL-1Taq聚合酶,以及其他增强剂和稳定剂)、引物和DNA模板3因素设5个水平,各因素水平分别为Master Mix 9.5、10.5、11.5、12.5和13.5 μL;正反向引物各0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 μmol·L-1;DNA模板30、40、50、60和70 ng。依据比较因素梯度的变动,调整ddH2O量以保证反应体系为25 μL。

1.2.2SRAP扩增优化后的梨SRAP反应体系为:25 μL体系中含模板DNA 40 ng,正反向引物浓度各1.2 μmol·L-1,Master Mix 12.5 μL。PCR扩增程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,35 ℃退火1min,72 ℃延伸1 min,共5个循环;再94 ℃变性1 min,52 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35个循环;最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。扩增产物用1.8%琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳分离,Bio-Rad凝胶成像系统扫描分析。对部分比较模糊的扩增产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证后记带。

选用表型差异较大的‘威宁大黄梨’、‘福泉葫芦梨’和‘兴义海子梨-1’作为筛选引物的材料,按照已筛选出来的体系,参照SRAP反应程序,从64对引物组合中筛选出带型好、多态性高、稳定性和重复性好的引物作为本试验的SRAP扩增引物。

1.2.3数据处理与分析按照Clark的方法[13],根据SRAP扩增结果电泳图谱中DNA条带的有无,无带记为0,有带记为1,并构建二元数据矩阵。应用POPGENE 1.31[14]软件进行遗传多样性参数分析,计算多态性引物的多态位点百分率(PPB)、总等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Shannon’s信息指数(I)、Nei’s基因多样性指数(H),并对各参数进行t检验来评价SRAP标记与ISSR标记的差异显著性,在DPSv7.05软件中进行。用NTSYSpc2.1[15]软件以Dice相似系数采用非加权类平均法(UPGMA)进行聚类分析,并进行遗传距离之间的Mantel 相关性检验。

2结果与分析

2.1引物筛选及多态性分析

从64对SRAP上下游组合引物中(表2),筛选出15对条带清晰、多态性丰富、重复性好的SRAP引物组合,对59份贵州砂梨种质基因组DNA进行扩增,统计结果见表3。15对SRAP引物共扩增出151条带,其中多态性带120条,多态百分率为79.47%,说明贵州砂梨种质资源遗传多样性较为丰富,个体间遗传差异较大。不同引物组合扩增条带的多态性百分率不同,引物组合EM2-me6多态位点百分率最高,为92.25%,而引物组合EM2-me5的多态位点百分率最低,为 63.64%。64对引物组合对‘兴义海子梨-1’的扩增产物电泳结果如图1所示。

2.2聚类分析

根据15对SRAP引物对供试材料的扩增数据,以Dice相似系数采用UPGMA聚类,得到的梨系统关系树如图2所示。在遗传相似系数0.75处,可将59份砂梨资源分为6组,其聚类结果具有一定的地理区域特性。第Ⅰ组仅有1份黔西南州晴隆县梨资源;第Ⅱ组包含晴隆‘瓢把梨-2’、‘兴义海子梨’、‘安顺箐口梨’、‘福泉葫芦梨’以及‘册亨金盖梨’等在内的28份梨资源;第Ⅲ组以黔东南州台江县以及黄平县的梨资源为主,此外,还包括来自仁怀市的3份资源以及‘威宁-4’,共11份梨资源;第Ⅳ组以荔波县以及印江县的梨资源为主,还包括2份仁怀的梨种质,以及1份赫章的梨资源,从兴义市取材的野生砂梨资源也归在此类。第Ⅴ组包含‘晴隆-3’、‘晴隆响水梨’以及‘晴隆瓢把梨-1’等3份梨资源;第Ⅵ组为‘威宁大黄梨’和‘威宁-3’。

2.3遗传多样性分析

根据POPGENE软件对不同区域品种材料各项遗传多样性参数进行分析,结果(表4)表明,在物种水平上,多态位点百分率(PPB)为79.47%,有效等位基因数(Ne)1.355 9,Nei’s遗传多样性指数(H)0.261 9,Shannon’s信息指数(I)0.336 2。在区域品种群水平上,以黔西南州遗传多样性最高(PPB=70.20%,Ne=1.330 0,H=0.201 9,I=0.312 2),六盘水市最低(PPB=27.15%,Ne=1.178 8,H=0.103 8,I=0.153 8)。

表2　SRAP引物序列

表3　SRAP引物组合的扩增结果及多态性

M.DL2000;1～64.64对SRAP引物组合

图2　基于SRAP的59份砂梨种质资源的分子聚类分析

区域品种群Population样本数No.ofindividuals有效等位基因数Meanobservednumberofalleles(Ne)Nei’s遗传多样性指数Nei’sgeneticdiversity(H)Shannon’s信息指数Shannon’sindexofdiversity(I)多态位点百分率Percentageofpolymorphicloci(PPB)/%黔西南州Qianxi’nanPrefecture261.33000.20190.312270.20黔东南州QiandongnanPrefecture71.30480.18290.277956.29铜仁地区TongrenPrefecture41.18380.10800.161529.80遵义市ZunyiCity51.19350.11870.181836.42黔南州QiannanPrefecture71.30850.17780.263948.34六盘水市LiupanshuiCity31.17880.10380.153827.15毕节地区BijiePrefecture61.32840.19560.295156.95区域品种群水平Populationlevel1.26110.15550.235246.45物种水平Specieslevel591.35590.21690.336279.47

表5　基于SRAP砂梨种质各区域的遗传相似性系数和遗传距离

注:上三角为遗传相似性系数,下三角为遗传距离。

Note:Nei’s genetic identity(above diagonal) and genetic distance(below diagonal).

2.4区域品种群分化趋势和亲缘关系

根据POPGENE软件计算的各区域品种群之间遗传距离和遗传相似性系数结果(表5),以黔西南州和六盘水市砂梨种质资源的遗传距离最近(0.037 8),相似系数最高(0.962 9);黔东南州和铜仁地区的遗传距离最远(0.253 1),遗传相似系数最低(0.776 4)。贵州砂梨种质在不同区域品种群之间的平均遗传距离为0.107 6,平均遗传相似系数为0.889 5。

3讨论

3.1贵州砂梨种质资源的遗传多样性

用筛选到的15对引物对贵州59份砂梨种质进行SRAP-PCR扩增,共扩增出151条带,其中多态性带120条,平均多态百分率为79.47%,低于玉苏甫等[16]的研究结果(96.95%),但高于赵广等[17](36.2%)以及齐丹等[18](56.6%)的研究结果,这与不同研究者所选材料的数量以及遗传背景有关,贵州砂梨种质资源虽不及新疆梨遗传背景复杂[16],但经过长期的地理隔离与进化,也具有较高的遗传多样性,保护和利用这些地方砂梨种质对培育或改良新品种具有重要意义。

将贵州59份砂梨种质分为7个区域品种群采用POPGENE进行遗传多样性分析,结果表明黔西南地区砂梨种质遗传多样性最高,六盘水市相对较低。将SRAP分析结果与ISSR结果[6]进行t测验,发现二者在多态性位点百分率(PPB)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样性指数(H)及Shannon’s信息指数(I)上都没有显著性差异(P>0.05),表明SRAP标记与ISSR标记在揭示贵州砂梨种质遗传多样性上具有高度的一致性。

3.2贵州砂梨种质资源的亲缘关系

通过NTSYSpc2.1对贵州59份砂梨资源进行聚类分析,与ISSR聚类结果类似[6],生态环境相似、地理来源相邻地区的砂梨种质遗传关系较近,往往划分为同一组,具有明显的地域分布规律,但‘威宁大黄梨’和‘威宁-3’在SRAP分析中单独聚为第Ⅵ组,而在ISSR分析中则并未与黄平县的梨分开;而从遗传距离看,ISSR标记的遗传距离(0.65～0.88)却比SRAP标记(0.72～0.93)更大;表明相较于ISSR标记而言,SRAP标记能在更小的变异范围内揭示更多的遗传信息。这可能是由于SRAP标记检测的是表达区域序列ORFs[7],其中外显子是转录序列,因此能够提供比检测重复序列间片段的ISSR标记更为准确的信息。

在区域品种群分化趋势及亲缘关系分析中,SRAP与ISSR结果也出现了分歧,表现为:SRAP标记结果认为黔西南州与六盘水市砂梨种质资源的遗传距离最近(0.037 8),黔东南州与铜仁地区的遗传距离最远(0.253 1);而ISSR结果则支持黔西南州与毕节地区遗传距离最近(0.046 5),黔东南州与安顺市的遗传距离最远(0.345 3);且2种标记产生的遗传距离矩阵之间并不存在显著相关性(r=-0.065 95,P=0.422 3)。用不同的标记技术从不同的水平和角度分析种质间的遗传差异,其结果就不可能是简单的重复或完全的一致,在某些情况下获得的结果甚至相互冲突[19-20]。以一种方法代替另一种方法,或以一种方法解释另一种方法是不妥的,将2种方法结合起来分析,可以获得更合理的研究结果[21]。本研究表明,仅从遗传距离与地理距离的相互关系看,SRAP标记计算的区域品种群间遗传距离大小与地理距离远近具有更好的一致性。

本试验采用SRAP标记对贵州59份砂梨种质进行遗传多样性分析,认为贵州砂梨资源遗传多样性水平高,并表现出明显的地理区域特性。SRAP标记与ISSR标记在揭示贵州砂梨种质遗传多样性上具有高度的一致性,但SRAP标记能在更小的变异范围内揭示更多的遗传信息。

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(编辑:宋亚珍)

Introduction of the Plant Front Cover:PrimulafilchneraeKnuth

PrimulafilchneraeKnuth is an annual herbal plant belonging to Primulaceae,with a height from 8 to 40 cm.The whole plant is densely covered by white multicellular hairs.Aerial stem short or absent,fibrous root more or less.Leaves forming a rosette,ovate or ovate-lanceolate,with petiole 3.5-15 cm long,2-5 cm wide,obtuse at apex,margin sinuate-crenate,with grey short hair on both sides;petiole 2.5-5.5 cm,obtuse at base.Scapes 8-40 cm,with dense white multicellular hairs,hollow,one to many arising from the rosette.Umbel 3-10(-12) flowered,pedicel 1.5-2.5 cm;bract linear-lanceolate,8-10 mm long;calyx coniform,5-10 mm long,ca.4 mm wide,glandular,parted nearly to the middle,lobes lanceolate,inflated at fruit;corolla purple to pink,tube 5-8 mm,limb 1.5-2.5 cm wide;5-parted at the top,lobes obcordate,apex slightly 2-lobed,pink with violet,colored by obcordate saffron yellow to purple plague.Flowers heterostylous.Pin flowers: stamens at middle of corolla tube;filament short or absent,stamens yellow,style 6-8 mm,slightly higher than annulus.Thrum flowers: style 4-5 mm,stigma green,hidden in stamens.Ovary spherical,ovule multiple,free-central placentation.Capsule subglobose,exocarp membranous,indehiscent or dehiscent at top.Seeds globose,1.5 mm in diam.,brownish-black when maturity,surface wrinkled.Flowers February to April,fruits March to May.

Primulafilchneraeis endemic to China,and is listed as one of the keystone protective species of Shaanxi Province.The species usually grows on moist sandstone soils near natural secondary broad-leaved deciduous forest,900-1 000 m in elevation,with its distribution area somewhat limited.SincePrimulafilchneraeKnuth (Primulaceae) was firstly collected by W.Filchner in 1904,no extant wild population was found in more than one hundred years,which made people believe this species to be extinct.At the present time,only two populations were rediscovered in Hubei Province in 2006,and one population was found in Shaanxi province in 2015.

(Photographed and introduced by ZHANG Jianqiang)

Genetic Diversity ofPyruspyrifoliaResources in Guizhou Province Using SRAP Markers

HUANG Wei1,2,LU Min2,ZHANG Qi2,AN Huaming2*

(1 Guizhou Horticultural Insitute,Guiyang 550006,China;2 Agricultural College,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Abstract:Genetic diversity and genetic relationship of 59 Pyrus pyrifolia germplasm resources distributed in Guizhou Province were analyzed using SRAP markers.The results showed that:(1)15 SRAP primer pairs generated 151 bands and 120 presented polymorphic loci.(2)A relatively high level of genetic diversity was revealed by Ne (mean observed number of alleles) 1.355 9,H(Nei’s genetic diversity) 0.216 9,I (Shannon’s information index)=0.336 2 at species level and by Ne=1.261 1,H=0.155 5,I=0.235 2 at population level.Pear resource in Qianxinan Prefecture showed the highest genetic diversity and that in Liupanshui City showed the lowest.(3)Cluster analysis with UPGMA method showed that 59 P.pyrifolia germplasms could be grouped into six groups at genetic coefficient of 0.75.The result also indicated that P.pyrifolia resources distributed in Guizhou Province had abundant genetic diversity with obvious geographical feature.The genetic diversity and genetic relationship of the P.pyrifolia germplasms could be revealed effectively by SRAP markers,which provided more genetic information in a smaller range of variation as compared to ISSR.

Key words:Pyrus pyrifolia;germplasm resources;genetic diversity;SRAP

中图分类号:Q343+.5;Q789

文献标志码:A

作者简介:黄伟(1983-),男,硕士,主要从事果树种质资源与遗传育种研究。E-mail:chinacqhw@163.com*通信作者:安华明,博士,教授,主要从事果树生物技术与遗传育种研究。E-mail:anhuaming@hotmail.com

基金项目:贵州省科技攻关项目[黔科合农G字(2009)4003]

收稿日期:2015-07-29;修改稿收到日期:2015-10-09

文章编号:1000-4025(2016)02-0280-08

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.02.0280