春兰AGL6-3基因的克隆及实时定量表达分析

胡月苗,孙崇波,向　林,胡凤荣*

(1 南京林业大学 风景园林学院,南京 210037;2 浙江省农业科学院园艺研究所,杭州 310021;3 华中农业大学,武汉 430070)



春兰AGL6-3基因的克隆及实时定量表达分析

胡月苗1,孙崇波2,向林3,胡凤荣1*

(1 南京林业大学 风景园林学院,南京 210037;2 浙江省农业科学院园艺研究所,杭州 310021;3 华中农业大学,武汉 430070)

摘要:该研究以春兰(Cymbidium goeringii)正常花及其2枚侧瓣突变成唇瓣样的花瓣(简称:蝶花)为实验材料,采用 RT-PCR结合 RACE技术从春兰中分离出AGL6-3基因。序列分析表明,AGL6-3基因在春兰正常花和蝶花中序列相同,该基因含有1个720 bp长的开放阅读框(ORF),共编码239个氨基酸。系统进化树进行分析表明,该基因属于 MADS-box基因中AP1/AGL9组的AGL6同源基因,命名为CgAGL6-3(基因登录号为KU058679)。实时荧光定量表达分析表明,CgAGL6-3在春兰正常花和蝶花各花器官中表达存在差异。在正常春兰中CgAGL6-3基因在唇瓣中强烈表达,在主萼、侧萼及蕊柱中表达量较低,在侧瓣中则微乎其微;而在蝶花中CgAGL6-3基因在唇瓣中强表达,侧瓣中的表达量次之,在主萼、侧萼和蕊柱中的表达量相近且均较低。研究说明,CgAGL6-3基因可能在春兰蝶花侧瓣唇瓣化的过程中扮演重要角色。

关键词:春兰;AGL6-3基因;蝶花;实时荧光定量表达

花是被子植物特有的功能器官,在大多数被子植物中,花有4个典型的组成部分,它们分布在同心轮上。萼片组成了最外面的一轮,向内一轮由花瓣组成,作为雄性生殖器官的雄蕊位于第三轮,雌性生殖器官雌蕊位于第四轮并占据花的中心位置[1]。在双子叶植物中,Coen等[2]通过对拟南芥(Arabidopsisthaliana)和金鱼草(Antirrhinummajus)的花器官突变体研究,提出了花器官发育的ABC基因表达模型,为花器官发育调控基因的发展奠定基础。1995年Colombo等[3]通过对矮牵牛的研究提出了ABCD模型。随着研究的不断深入,有人从蛋白聚合体控制花器官的形成方面提出了四因子模型[4],该模型基于拟南芥花同源异型蛋白能够形成多聚体,具体作用如下:2A+2SEP决定萼片;A+2B+SEP决定花瓣;2B+C+SEP 决定雄蕊;2C+2SEP决定心皮。后来在四因子模型和经典ABC模型的基础上Theissen等提出ABCDE模型[5]。目前所获得的花器官发育基因中除了APETALA2(AP2)外,编码的蛋白质N端都包含一个保守区-MADS-box[6]。

目前主要针对双子叶模式植物拟南芥和金鱼草等进行了花器官发育的研究[7]。单子叶植物花器官发育的研究主要集中在禾本科植物,如水稻(Oryzasativa)[8]和玉米(Zeamays)[9]上。兰花作为单子叶植物中具有奇特花结构的植物,近期吸引了不少研究人员,并取得了不错的研究成果。

AGL6及其同源基因都属于MADS-box家族中E类基因的AP1/AGL9组。目前已从多种植物中克隆到了AGL6-like基因,如文心兰(Oncidiumhybridum)的OMADS1[10-11]、麻竹(Dendrocalamuslatiflorus)的OMADS18[12]、风信子(Hyacinthusorientalis)的HoAGL6[13]、水稻的OsMADS6和OsMADS17[14]、玉米的ZAG3和ZAG5[15-16]和中国水仙的NtMADS3[17]等。研究表明,在植物文心兰中AGL6类基因OMADS1在花分生组织、唇瓣和心皮中表达,但在营养叶、雄蕊、萼片和花瓣中并未检测到其表达[10],矮牵牛(Petuniahybrida)中AGL6亚家族基因PMADS4在萼片、花瓣、心皮中表达量高,在雄蕊中无表达。总体来说,由于缺少相关基因功能缺失突变体,因此对确定这类基因具体功能还有待研究。兰科植物是现今植物界中包含植物种类最多的科之一,含有超过20 000种兰花,兰花具有复杂的花型结构。春兰(Cymbidiumgoeringii)是兰科兰属植物,正常的春兰花由3枚萼片、2枚侧瓣和1枚唇瓣,以及处于中心部位的蕊柱组成(图1,A)。蝶花一般指2枚侧瓣或者2枚侧萼发生变异,质变成唇瓣样的花瓣,属于兰花花瓣的一种‘唇瓣化’现象(图1,B)。本研究采用RT-PCR及RACE技术获得了1个与花发育相关的CgAGL6-3基因,并对其进行了表达分析。通过本研究,为揭示AGL6类基因在兰花花器官发育过程中对侧瓣特化的机理奠定理论基础。

1材料和方法

1.1材料

取种植于浙江省农业科学院园艺所花卉中心温室内的春兰正常花和蝶花为实验材料,分别采集2 cm≤花芽≤3 cm时期的花瓣、萼片、唇瓣、蕊柱立即用液氮冻存,并放入-70 ℃的冰箱中备用。

1.2总RNA的提取和AGL6-3基因的克隆

用试剂盒(本实验室使用的是北京天恩泽基因公司RNAout 2.0试剂盒)分别提取春兰正常花和蝶花花芽的RNA,再用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(美国Clontech公司所生产)进行反转录合成cDNA第1链,以合成的第1链作为模板进行PCR扩增。根据AGL6类基因保守区域来设计引物,设计的引物为上游引物AGL6-3A(5′-ACGATCACGAAACCCTGAAC-3′)和下游引物AGL6-3B(5′-GCTGGTACCTCCCAATTTGA-3′)。根据设计的引物进行PCR扩增,PCR扩增条件为:94 ℃变性3 min,94 ℃变性30 s,60～50 ℃复性30 s(每进行5个循环退火温度下降2 ℃),72 ℃延伸1 min,总共进行35个循环后再72 ℃延伸5 min。用质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳进行切胶回收,连接到pEASY-Blunt Zero Cloning Kit载体上,42 ℃热激转入大肠杆菌Trans5α化学感受态细胞,Amp抗性筛选和X-gal/IPTG蓝白斑筛选。选取白色菌落进行PCR检测,阳性克隆并送去测序。

图1　正常的春兰(A)及蝶花(B)

根据扩增产物的测序结果设计3′-RACE引物AGL6-3C(5′-GGCAAAAGAGGACGCAGCTAA-TG-3′)和5′-RACE引物AGL6-3D(5′-GCTCTCAT-TGATCCACCATCTGC-3′)。

采用Clontech公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒进行3′端和5′端的RACE反应。将3′端和5′端的RACE反应产物分别回收,连接pEASY-Blunt Zero Cloning Kit载体,转化测序。拼接后获得基因全长。

1.3AGL6-3基因序列分析

将获得的基因全长cDNA序列,首先进行开放阅读框的分析(在http://au.expasy.org/tools/dna.htmL进行分析);之后用ProtParam软件来分析相关蛋白的基本性质,再用ClustalX 1.83软件进行氨基酸水平的序列比对。接下来构建系统进化树,首先在NCBI网页上用Blast 搜索CgAGL6-3基因的同源基因,使用ClustalX 1.83软件对搜索得到的基因进行多重序列比对,最后使用MEGA 6软件中的NJ法构建系统发育树,并进行Boot-strap检测[18]。

1.4CgAGL6-3基因的实时荧光定量表达分析

根据试剂盒(采用北京天恩泽基因公司RNAout 2.0试剂盒)说明书分别提取春兰正常花和蝶花的侧瓣、主萼、侧萼、唇瓣和蕊柱的RNA,用KAPA SYBR FAST qPCR Kit(天根生化科技(北京)有限公司)反转录成单链cDNA,之后用荧光染料法进行实时荧光定量表达分析。根据已克隆出的CgAGL6-3基因序列设计1对特异性引物,用18SrRNA基因作为内标。

18SrRNA基因上游引物为5′-GGTCCTATTGTGTTGGCT-3′,下游引物为5′-TCGCAGTGGTTCGTCTTT-3′。AGL6-3基因引物序列上游引物AGL6-3E(5′-TAACTTAGACGCAGAGCCCA-3′)和下游引物AGL6-3F(5′-GCCCATCCTGATATGAAACCG-3′)。qPCR-PCR反应在罗氏LightCycler 2.0荧光定量PCR仪上进行。反应条件为:95 ℃ 3 min,95 ℃ 3 s,60 ℃ 30 s,循环40次,每个处理重复3次。数据输出的结果用Microsoft Excel软件进行分析。

2结果与分析

2.1CgAGL6基因全长cDNA的克隆

用RT-PCR技术从春兰花芽中获得部分基因片断,测序并在NCBI上分析表明,该片段为目的片段,即为CgAGL6-3基因的部分片段。根据所得序列设计3′-RACE和5′-RACE特异引物,按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit的说明书进行cDNA末端扩增,获得了3′和5′的扩增片段,测序后将两端拼接得到基因全长cDNA序列(图2)。Blastx的结果显示,全长cDNA与其他植物AGL6类基因有较高的同源性,该基因含有1个720 bp长的开放阅读框,共编码239个氨基酸,将基因命名为CgAGL6-3,Gen-Bank登录号为KU058679。CgAGL6-3分子量为27.5 kD,预测等电点为9.56。

2.2CgAGL6-3基因序列分析

氨基酸序列比对结果(图3)显示,CgAGL6-3蛋白与从春石斛(Dendrobiumhybrid)中克隆的DAGL6基因蛋白有较高的同源性,其中氨基酸序列具有92%的一致性。与AP1/AGL9组扇叶文心兰(Erycinapusilla)的EPMADS5以及文心兰(Oncidiumhybrid)OMADS1的蛋白也具有较高的同源性,且与两者的氨基酸序列都为90%的一致性。与粉花六出花(Alstioemerialigtu)的AlMADS和石刁柏(Asparagusofficinalis)的AoMADS分别有 71%和72%的一致性,春兰的CgAGL6-1与CgAGL6-3氨基酸序列的相似性为64.9%(图 3)。此为在该氨基酸的C端发现了典型的SEP/AGL6保守结构域(图3)。

系统进化树分析(图5)表明AP1/AGL9亚族分为AGL6、SEP和AP1三个分支,CgAGL6-3基因属于AGL6分支,与春石斛的DAGL6和文心兰的OMADS1关系最近,与其它植物AGL6类基因的相似性也较高,表明CgAGL6-3为AGL6的同源基因。

2.3CgAGL6-3基因在不同器官的表达分析

为了解CgAGL6-3基因的功能及确定CgAGL6-3基因在春兰正常花和蝶花不同花器官的表达差异,提取了春兰正常花和蝶花的主萼、侧萼、侧瓣、唇瓣和蕊柱的RNA,并进行实时荧光定量表达分析。将基因在正常花蕊柱的表达量设定为1,结果表明(图4),在正常花中CgAGL6-3基因表达主要集中在唇瓣中,在主萼、侧萼及蕊柱中表达较少,在侧瓣中几乎不表达。而在蝶花中CgAGL6-3基因表达量在唇瓣中最高,侧瓣中的表达量次之,在主萼、侧萼和蕊柱中的表达量都很低。综合来看,蝶花中唇瓣的表达量最高,正常花中唇瓣的表达量次之,约为蝶花中唇瓣表达量的45%,蝶花中侧瓣的表达量为蝶花唇瓣的19%,而正常花侧瓣中CgAGL6-3基因表达量仅占蝶花唇瓣表达量的0.001%。

1.DL2000;2.AGL6-3

扇叶文心兰.EpMADS5(AHM92081);文心兰.OMADS1(ADJ67237);春石斛.DAGL6(AHA42267);

图4　春兰CgAGL6-3在各花器官中的表达

除了图2中用于多序列比对的部分基因序列外,其它序列来源为:蕙兰.CfAGL6(ADI58465);建兰.CeAGL6(AFM97201)、

3讨论

目前,MADS-box基因是研究最多的植物转录因子之一,这一类基因广泛存在于真核生物中[18],通过对拟南芥和金鱼草突变体的遗传和分子特性研究揭露MADS-box基因盒对花器官发育起着很重要的作用[1]。之前对单子叶植物花发育研究主要以经济作物水稻和玉米等为主,但这些植物的花结构高度特化不适合用来研究花器官发育,因此对于揭开单子叶植物花发育的各个谜团兰科植物特化的花结构是非常合适的研究对象[19]。本研究采用同源序列法和RACE技术从春兰正常花以及侧瓣唇瓣化的蝶花中都克隆出了一个E类基因。该基因属于兰科植物AP1/AGL9组的AGL6-like类基因,命名为CgAGL6-3。

研究表明,兰花唇瓣的形成原因并无法单纯的由B类基因来解释,并提出兰花唇瓣的形成受蛋白复合物的调控,B类基因的蛋白必须与一群AGL6的蛋白形成蛋白四聚体,在兰花中这种复合物有两种,一种是‘唇瓣复合物’(L complex),另一种是‘花萼/花瓣复合物’(SP complex)。在兰花中这两种复合物相互竞争,当‘唇瓣复合物’占优势花器就发育成唇瓣,当‘花萼/花瓣复合物’占优势时花器就往花萼/花瓣发展,若两者同时等量存在就会产生唇瓣与花萼/花瓣的中间型产物[20]。

孙崇波等[21]研究表明,CgAGL6-1基因在春兰的不同部位表达量不同,在花器官中表达量从高到低的部位顺序为唇瓣、侧瓣、萼片和蕊柱,这与春兰蝶花的CgAGL6-3基因表达相似,说明春兰CgAGL6-1和CgAGL6-3基因可能存在部分功能冗余。目前对CgAGL6-3基因在花器官的不同组织上的表达分析可知,在春兰正常花中CgAGL6-3基因在唇瓣中强烈表达,在主萼、侧萼、及蕊柱中表达量较低,在侧瓣中则微乎其微。而在蝶花中CgAGL6-3基因表达量在唇瓣中最高,侧瓣中的表达量次之,在主萼、侧萼和蕊柱中的表达量相近且都较低。这些说明CgAGL6-3基因可能在春兰侧瓣特化成唇瓣过程中起到一定的作用,而这与Hsu等[10]研究发现文心兰AGL6类基因OMADS1有相似之处,OMADS1基因在2 mm和10 mm的花芽中均有表达,且在10 mm的花芽中表达较强,研究表明在10 mm的花芽中,OMADS1基因在唇瓣和心皮中表达,且在唇瓣中表达较强,但OMADS1基因与Chang等[22]发现的文心兰OMADS7基因在萼片、侧瓣、唇瓣和心皮中都有表达不同。综合来看春兰CgAGL6-3基因在蝶花唇瓣中如此高的表达量可推测CgAGL6-3基因对春兰唇瓣的形成起一定的推动作用。至于CgAGL6-3基因在春兰中如何行使其功能今后我们将对其做进一步研究。

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(编辑:宋亚珍)

Cloning and Real-time Expression ofAGL6-3 Gene fromCymbidiumgoeringii

HU Yuemiao1,SUN Chongbo2,XIANG Lin3,HU Fengrong1*

(1 College of Landscape Architecture,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China;2 Institute of Horticulture,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021,China;3 Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)

Abstract:The study used Cymbidium goeringii wild type and peloric mutant (two lateral petals mutated into lips) as experiment materials.In this research,a novel AGL6-3 gene was isolated from C.goeringii by RT-PCR and RACE-PCR techniques.Sequence analysis showed AGL6-3 gene sequences are same in the wild type and peloric mutant of C.goeringii.The gene contained an open reading frame of 720 bp encoding a putative protein of 239 amino acids.Phylogenetic tree analysis indicated that CgAGL6-3 belongs to AGL6 clade of AP1/AGL9 subfamily,named CgAGL6-3 (GenBank accession No.KU058679).Real-time quantitative PCR demonstrated that,in wild type CgAGL6-3 was highly expressed in lips,lower in dorsal sepal,lateral sepal,column,and very little in lateral petal.Whereas expression of CgAGL6-3 in peloric mutant was the highest in lip,lateral petal comes second,lower and close in dorsal sepal,lateral sepal and column.These results indicated that CgAGL6-3 play a important role in the process that lateral petals specialized into lips.

Key words:Cymbidium goeringii;AGL6 gene;peloric mutant;real-time quantitative PCR

*通信作者:刘虎岐,博士,副教授,硕士生导师,主要从事植物发育生物学及分子生物学的研究。E-mail:liuhuqi@nwsuaf.edu.cn

中图分类号:Q785;Q786

文献标志码:A

作者简介:胡月苗(1990-),女,硕士研究生,主要从事园林植物遗传育种方面研究。E-mail:281171089@qq.com*通信作者:胡凤荣,副教授,主要从事园林植物遗传育种方面研究。E-mail:hufengrong2003@sina.com 张婷(1989-),在读硕士研究生,主要从事花发育基因研究。E-mail:yuerzt@163.com

基金项目:林业公益性行业科研专项(201304117);国家青年自然科学基金(31300583,31400593);浙江省公益技术研究农业项目(2014C32100) 中医药行业科研专项(201207002);中医药公共卫生专项(财社[2011]76号)

收稿日期:2015-12-26;修改稿收到日期:2016-01-25 2015-10-28;修改稿收到日期:2016-01-06

文章编号:1000-4025(2016)02-0225-06 1000-4025(2016)02-0231-10

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.02.0225 10.7606/j.issn.1000-4025.2016.02.0231