自创封闭穿刺技术应用于骨肿瘤诊断的动物实验研究

魏然　孔庆柱　赵景新　金宇

067000 承德，承德医学院附属医院骨外四科



自创封闭穿刺技术应用于骨肿瘤诊断的动物实验研究

魏然孔庆柱赵景新金宇

067000 承德，承德医学院附属医院骨外四科

【摘要】目的探讨自创封闭穿刺技术在诊断骨肿瘤中的应用价值。方法用30只雄性新西兰大白兔建立兔VX2骨肿瘤动物模型，将其随机分成VX2实验组与VX2对照组各15只，VX2实验组采用自制封闭穿刺装置进行肿瘤部位的穿刺活组织检查(活检)，穿刺后封堵骨孔；对照组则采用传统穿刺活检装置，穿刺后未封堵骨孔。采用彩色多普勒超声检查(彩超)及病理学检查对2组穿刺效果进行评估与比较。结果穿刺1 h后，彩超显示VX2实验组封闭栓均无脱落，其中2只(13.3%)穿刺孔出血，形成血肿，其余13只穿刺孔周围无明显液体渗出；VX2对照组14只(93.3%)穿刺孔有出血，形成血肿，剩余1只无明显出血，2组出血率比较差异有统计学意义(P<0.001)。VX2实验组穿刺针道软组织中未发现瘤细胞，而VX2对照组有14只(93.3%)发现瘤细胞，2组肿瘤细胞扩散率比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论该自创封闭穿刺技术安全、并发症少，可应用于骨肿瘤的诊断。

【关键词】骨肿瘤；动物模型；穿刺；活组织检查；自制装置

骨肿瘤的诊断是骨科难题，虽然目前的影像学技术中X线、CT、MRI及计算机断层扫描(ECT)等能初步鉴别骨肿瘤的良恶性，但却很难明确诊断。穿刺活组织检查(活检)技术对临床治疗前判断肿瘤组织的良恶性、组织分型、分化程度等都有很大的帮助，对于治疗方案的选择具有重大意义。因此，穿刺活检技术逐渐成为了骨肿瘤诊断、术前治疗的重要手段。目前的穿刺活检技术及器械种类繁多，穿刺阳性率较高，但尚不能解决穿刺孔出血、局部转移等不足之处，我科总结大量临床经验，发明了一种封闭骨孔的器械和穿刺骨组织的装置，通过兔VX2骨肿瘤动物模型建立了一种封闭穿刺技术，以助临床改善穿刺活检技术的不足，现将结果报告如下[1]。

材料与方法

一、材　料

本实验于2014年1月至2015年5月在我院中心实验室完成。 实验动物为雄性新西兰大白兔33只，月龄3～4个月，体质量1.5～2.0 kg，由天津津南区春乐实验动物养殖场提供，实验前饲养1周。本实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。肿瘤细胞为兔VX2肿瘤组织块，由广州吉妮欧生物试剂公司提供。

二、仪　器

本实验的仪器包括：封闭穿刺针(实验中用此针穿刺皮肤、软组织、骨皮质，图1A、B)、实验用封闭栓(图1C) 、超声诊断扫描仪(GE Medical Systems-LOGIQ9)、光学显微镜(OLYMPUS-BX53)。

图1　封闭穿刺装置

A：套管针；B：穿刺针内芯，为实心；C：封闭栓(箭头)，穿刺活检后将封闭栓植入套管尾部，将环形套安装入穿刺针内芯(使穿刺针内芯插入套管后最尖部与套管部平齐)，用穿刺针内芯通过套管将封闭栓顶置，刚好将封闭栓安放置穿刺点

三、方　法

1. 兔VX2肌肉肿瘤模型的建立

将兔VX2肿瘤组织块复苏后离心去除上清液，取沉淀物置于1 ml磷酸盐缓冲液(PBS)中，用眼科剪将组织剪碎为0.5～1.0 mm3大小的组织块，用1 ml PBS重悬组织块成混悬液，将其注射到实验兔(随机抽取1只)的大腿肌肉内，标准饲养，14 d后局部触及肿块，大小约4×4 cm2，建立兔VX2肌肉肿瘤模型成功，即获得大量肿瘤细胞待用。

2. 种植VX2肿瘤细胞，建立兔VX2骨肿瘤模型

制备兔VX2骨肿瘤模型前，随机挑选出3只兔子作为空白对照组，与后续兔VX2骨肿瘤模型共同接受穿刺。

剩余30只兔子于实验前禁食10 h，于无菌条件下取出传种兔肿瘤组织块，制成0.5～1.0 mm3组织块，用1 ml PBS重悬组织块成混悬液。30只实验兔采用3%戊巴比妥钠(1 ml/kg)耳缘静脉麻醉，将其右侧胫骨上段局部去毛消毒，于胫骨近端前缘平面(约为胫骨平台下1 cm，偏内侧0.5 cm处)进行操作，在胫骨干骺端用克氏针(直径2 mm)钻洞直至骨髓腔[2]。将肿瘤组织混悬液植入骨髓腔内，用骨蜡封口，用医用酒精冲洗周围组织，逐层缝合皮下组织、皮肤。左侧不予处理。标准饲养，4周后将成功建立的兔VX2骨肿瘤动物模型作为实验穿刺对象[3]。

3. 对兔VX2骨肿瘤模型进行穿刺

对兔VX2骨肿瘤模型耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(1 ml/kg)将其麻醉后，于其小腿胫骨结节表面剃除毛发，采用俯卧位将其固定于手术台上。常规碘伏消毒，铺无菌孔单。将30只实验兔随机分成2组各15只，一组为VX2实验组，另一组为VX2对照组。对2组的双侧小腿背侧进行穿刺。VX2实验组采用自制封闭穿刺装置及技术进行穿刺，然后缝合。VX2对照组采用传统穿刺活检装置及技术，对穿刺孔不封堵，采用按压的方式，然后缝合。术后预防性使用抗生素。

采用自制封闭穿刺装置及技术进行穿刺的方法如下：将图1B的穿刺针内芯放入图1A的套管针内，组合式穿刺到达骨皮质，套管针位置不动，穿刺针内芯旋转式进入骨髓腔，套管针保持位置不动，拔出针芯，插入病理针，获取肿瘤组织，取出病理针，保持套管针位置不动，将封闭栓从针尾放进套管针，用穿刺针内芯顺套管针方向将封闭栓顶置骨孔内进行封堵，最后取出套管针和穿刺针内芯。

4. 术后评定

穿刺1 h后，对实验兔小腿穿刺部位行彩色多普勒超声检查(彩超)，观察穿刺孔周围出血情况，比较VX2实验组与VX2对照组的出血率。

于穿刺后4周内，采用静脉注射过量乌拉坦深麻醉法处死3组兔，取空白对照组小腿近端背侧正常软组织和VX2实验组与VX2对照组穿刺针道软组织，将所取组织浸泡于4%甲醛溶液中固定，然后进行石蜡包埋、切片并进行苏木素-伊红染色，将各组软组织病理学检查结果进行比较，分析VX2实验组与VX2对照组肿瘤扩散情况。

四、统计学处理

采用SPSS 19.0处理数据，2组间计数资料的比较采用Fisher确切概率法。P<0.01为比较差异有统计学意义。

结果

一、VX2实验组与VX2对照组的出血率比较

2组均1次成功获取肿瘤组织。穿刺1 h后，彩超显示VX2实验组封闭栓均无脱落，其中2只(13.3%)穿刺孔出血，形成血肿，其余13只穿刺孔周围无明显液体渗出(图2A)；VX2对照组14只(93.3%)穿刺孔均有出血，形成血肿(图2B)，剩余1只无明显出血，2组出血率比较差异有统计学意义(P<0.01)，实验组出血率较低。

图2　VX2实验组与VX2对照组彩超图

A：VX2实验组穿刺后1 h，箭头所指为封闭栓，可见封闭栓封堵穿刺孔，穿刺孔周围层次清晰，肌肉组织回声均匀，穿刺孔无渗漏及出血情况；B：VX2对照组穿刺后1 h，穿刺孔周围回声不均匀(箭头所指区域的低密度影)，可见不规则低回声，较杂乱，其内可见片样偏高回声，穿刺孔周围有渗漏及出血情况

二、VX2实验组与VX2对照组的肿瘤扩散情况比较

空白对照组病理学检查结果正常。VX2实验组穿刺针道软组织中未发现瘤细胞(图3A、B)，VX2对照组14只(93.3%)发现瘤细胞(图3C、D)，2组肿瘤细胞扩散率比较差异有统计学意义(P<0.01)，VX2实验组肿瘤细胞扩散率较低。

讨论

近年来，恶性骨肿瘤已逐渐成为中国居民死亡的主要原因[4]。骨骼系统中骨骼病变首选最基础的检查方法是X线片检查，此法可以清晰显示骨结构和骨骼病变的大体范围、骨质破坏情况以及周围软组织情况。对于内部结构、周围软组织不清等情况，可进一步行CT、MRI及ECT检查。但在骨肿瘤诊断中，若想得到更为确切的结果，最好行穿刺活检。

穿刺活检作为临床骨肿瘤重要的辅助检查技术，具有操作方法简便、对组织损伤小、出血少、感染机会小以及不影响二次手术治疗方案的选择等优点。该项技术缺一不可的材料是穿刺针。穿刺针多种多样，包括三爪形套管活检针、组合式穿刺活检套钳、恩特利活检针、自制隧道式穿刺针、弹簧芯状活检针、三齿软组织切割针等[5-10]。穿刺活检技术虽然已经广泛应用于临床，但如何避免穿刺处出血、肿瘤细胞针道转移、污染周围组织等并发症尚未解决[11-15]。

我科总结大量穿刺活检经验，在现有穿刺技术的基础上自制了封闭穿刺装置，其能隔绝穿刺孔道与皮质外正常软组织接触，使骨髓腔与外界形成通道，通过病理针由此通道中取出肿瘤组织，完成后由封闭栓封闭骨孔。本研究结果显示，自制封闭穿刺装置的出血率明显低于传统装置，也能更好地控制肿瘤细胞的扩散。

图3　VX2实验组与VX2对照组病理图(苏木素-伊红染色，A、C×10，B、D×40)

A、B：VX2实验组穿刺后病理图，可见正常疏松结蹄组织，肌纤维纵切面可见明暗相间的横纹，核多，且位于细胞周边，软骨囊内软骨细胞正常，软骨基质内有大量弹性纤维，病理诊断为正常骨骼肌组织、正常脂肪组织；C、D：VX2对照组穿刺后病理图，骨周围软组织可见异性肿瘤细胞浸润，瘤细胞呈片巢状排列，细胞多角形或卵圆形，核大浓染，癌细胞巢中可见角化珠形成，病理诊断为鳞癌

本课题组在成功建立兔VX2骨肿瘤动物模型的基础上采用自创封闭穿刺技术，克服了现有的骨组织穿刺工具难以在穿刺取样后及时封闭骨孔的缺陷。封堵骨孔的封闭栓由医用高分子聚合物材料制成，人类对其免疫排斥反应较小，而且其为环状翅片、有成对倒钩，直径均大于套管针通道的内径，可有效固定并密封穿刺孔。该自制封闭穿刺技术安全、并发症少，值得在临床推广应用。

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(本文编辑：洪悦民)

Application of home-made puncture technique for diagnosis of bone tumor in animal models

WeiRan,KongQingzhu,ZhaoJingxin,JinYu.

TheFourthEndemicArea,DepartmentofOrthopedics,theAffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the application value of home-made puncture technique in the diagnosis of bone tumors in rabbit models. MethodsThirty New Zealand male rabbits were used to establish VX2 bone tumor models and randomly divided into the experimental (n=15) and control groups (n=15). In the experimental group, puncture biopsy was performed by a home-made puncture device and the bone holes were occluded subsequently. In the control group, puncture biopsy was conducted by using a conventional puncture device whereas the holes were left open. The puncture effect was evaluated and statistically compared between two groups by color Doppler Ultrasound and pathological examination. ResultsAt 1 h after puncture, color ultrasound revealed no signs of device separation. Hemorrhage and hematoma were observed around the puncture hole in 2 animals (13.3%) and no apparent fluid effusion was detected in the remaining 13 in the experimental group, significantly different from those in the control group, 14 animals (93.3%) had hemorrhage and hematoma surrounding the puncture hole and the other 1 had no evident hemorrhage (P<0.001). In the experimental group, no tumor cells were detected in the soft tissue of puncture tract whereas 14 animals(93.3%) in the control group, the dissemination rate of tumor cells significantly differed between two groups (P<0.01). ConclusionsHome-made puncture technique is a safe diagnostic tool of bone tumors and yields slight complications.

【Key words】Bone tumor; Animal model; Puncture; Biopsy; Home-made device

(收稿日期：2015-08-26)

Corresponding author,Jin Yu,E-mail：792027135@qq.com

通信作者，金宇，E-mail：792027135@qq.com

基金项目：河北省省级重大医学科研课题(zd2013048)

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.02.007

·基础研究论著·