解冻后囊胚形态学评分对复苏单囊胚人工周期移植临床妊娠的影响

李为玉　陈攀宇　方丛　梁晓燕

510610 广州，中山大学附属第六医院生殖医学中心



解冻后囊胚形态学评分对复苏单囊胚人工周期移植临床妊娠的影响

李为玉陈攀宇方丛梁晓燕

510610 广州，中山大学附属第六医院生殖医学中心

【摘要】目的分析在玻璃化冷冻复苏单囊胚移植周期中，解冻后囊胚扩张程度、内细胞团和滋养细胞质量对临床妊娠的影响。方法收集1 005例第一周期复苏单囊胚移植的资料，进行囊胚扩张、内细胞团和滋养细胞评分，采用二分类Logistic回归(Enter法)分析，评估3项评分及年龄对临床妊娠的影响。结果解冻后第5日单囊胚(D5)移植组、第6日单囊胚(D6)移植组的临床妊娠率分别为54.61%、38.49%，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)，D5移植组女方年龄低于D6组(P<0.01)；D5单囊胚解冻后内细胞团评分低和年龄大是临床妊娠结局的危险因素(OR=1.733，95%CI：1.213~2.475；OR=0.938, 95%CI：0.906~0.972，P均<0.001)，囊胚扩张程度及滋养细胞与妊娠结局无关(P均>0.05)；D6囊胚解冻移植中妊娠与非妊娠组的囊胚扩张程度、内细胞团、滋养细胞均与妊娠结局无关。结论在进行冷冻复苏单囊胚移植时，D5囊胚优先考虑内细胞团质量。

【关键词】单囊胚移植；冷冻复苏胚胎移植；形态学评分；内细胞团；滋养层细胞

Morphological scoring; Inner cell mass;Trophectoderm

随着体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术的飞跃发展以及治疗经验的不断积累，多胎妊娠发生率不断升高，单胚胎移植已成为国内外专家的共识[1-2]。囊胚培养有利于挑选发育潜能较高的胚胎[3]。其中如何挑选囊胚进行单胚胎移植成为临床的关键。囊胚质量有3项评价指标：胚胎扩张程度、内细胞团和滋养细胞质量[4]。当这3项指标达到最佳状态时妊娠率最高，然而每一项指标预测妊娠结局的能力仍不清楚。有研究认为胚胎发育和扩张等级是预测种植成功与否的重要指标[5-6]。Shapiro等[7]认为内细胞团质量与种植率相关，Gardner等[8]认为滋养细胞质量与种植率呈正相关。本研究回顾分析了本中心1 005例玻璃化冷冻复苏第一周期单囊胚移植的临床妊娠结果，探讨临床妊娠结局与囊胚扩张程度、内细胞团、滋养细胞质量的相关性，以期更好地指导临床工作。

材料与方法

一、研究对象

2010年6月至2015年4月在我中心第一周期行冷冻复苏单囊胚移植1 005例。其中第5日单囊胚(D5)移植727周期(D5移植组)，第6日单囊胚(D6)移植278周期(D6移植组)。纳入标准：①患者既往无冷冻移植周期，此次为第一周期复苏单囊胚移植；②女方年龄小于或等于45岁；③已使用激素替代治疗(HRT)周期进行内膜准备。排除标准：有子宫腺肌症、宫腔粘连、移植日子宫内膜小于7 mm者。

二、方　法

1. 囊胚培养及囊胚评分

常规体外受精或单精子胞浆内注射受精(ICSI)，受精后第3日将符合囊胚培养评分标准的胚胎转移至囊胚培养基(G5 series，瑞典)行囊胚培养[9]。第5、6日观察胚胎并按照Gardner评分系统对胚胎扩张进行评分：根据囊腔扩张程度进行分期，囊腔小于胚胎体积的50%为1期，超过50%为2期，占满整个胚胎为3期，囊腔扩张、透明带变薄为4期，囊胚开始从透明带里孵出为5期，囊胚完全孵出为6期[10]。对处于3~6期的囊胚内细胞团和滋养外胚层进行评分：①内细胞团评分，细胞数量多且分布紧密为A、细胞数量较少且分布松散为B、细胞数量极少则为C；②滋养外胚层评分，较多的细胞形成连接紧密的上皮层为A、较少的细胞连接松散为B、细胞少且体积大为C。以A为高、B为中、C为低。本中心胚胎冷冻的标准为：D5评分达3BB及以上的进行冷冻，若第5日未达以上标准，则继续培养至第6日再按照以上标准冷冻。当患者无符合3BB以上标准的囊胚时，经告知后并签署知情同意书后对次级胚胎进行冷冻。

2. 囊胚的冷冻与复苏

冷冻、复苏囊胚采用本中心常规玻璃化冷冻及复苏方法操作，囊胚在冷冻复苏后采用激光系统( ZILOS-tk Laser Zona Drill System，美国Hamilton Thorn Bioscience)进行辅助孵化，体外培养2～3 h后进行胚胎移植。

3.内膜准备

采用HRT准备内膜，自月经第3日开始使用戊酸雌二醇(补佳乐，拜耳)，根据内膜生长情况调整用量。内膜达到7 mm及以上且雌激素作用时间不少于10 d时开始肌内注射黄体酮40 mg/d，黄体酮注射后的第5日或第6日进行移植。

4.妊娠结局评价

移植后12日测血清β-人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)，若β-HCG> 50 U/L，则定义为妊娠。妊娠阳性者移植35 d后行阴道B超，见孕囊为临床妊娠。

三、统计学处理

结果

一、D5、D6移植组的一般情况及移植结局比较

根据纳入和排除标准筛选出1 005个周期。D5、D6移植组患者不孕年限、不孕类型、BMI、移植日子宫内膜厚度、胚胎复苏率、流产率、早产率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与D6移植组相比，D5移植组患者年龄较低、临床妊娠率较高(P均<0.01)，见表1。

二、D5、D6复苏囊胚评分与临床妊娠关系分析

D6复苏囊胚的妊娠与非妊娠组间年龄比较差异有统计学意义(P<0.05)，2组间胚胎扩张程度、内细胞团及滋养细胞比例比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。D5复苏囊胚的妊娠与非妊娠组间的胚胎扩张程度比较差异无统计学意义(P>0.05)，2组间内细胞团、滋养细胞和年龄比较差异均有统计学意义(P均<0.05)，见表2。Logistic回归分析(赋值：妊娠=1；非妊娠=0)发现低内细胞团评分对临床妊娠的OR值最高(1.733，95%CI：1.213～2.475，P<0.01)，年龄大也是临床妊娠结局的危险因素(OR=0.938，95%CI：0.906～0.972)，而滋养细胞及胚胎扩张程度与临床妊娠结局无关(P均>0.05)，见表3。

表1　D5、D6移植组的一般情况及妊娠结局比较

注：胚胎复苏率=复苏胚胎数/解冻胚胎数

表2　D5、D6移植组囊胚评分与临床妊娠结局的单因素分析

表3　D5移植组囊胚评分与临床妊娠结局的多因素分析

讨论

研究发现，在25~37岁患者中单囊胚与双囊胚移植后妊娠率分别为73.8%、77.5%，活产率分别为59.0%、60.7%，而后者双胎率高达47.6%[11]。多胎妊娠会导致一系列的产科并发症，如早产、流产、妊娠期高血压疾病等[12]。具有较高发育潜能的优质单囊胚在保证妊娠率的同时可有效降低双胎妊娠率，降低了产妇与围生儿的危险。我中心第一周期复苏单囊胚移植1 005周期数据显示，临床妊娠率为50.15%(504/1 005)。

囊胚的选择是单胚胎移植技术的关键，现阶段国内普遍采用囊胚Gardner形态学评分这一经典方法。胚胎扩张程度、内细胞团、滋养细胞这三者之间具有相对独立性，移植时给囊胚选择带来困惑[13]。Honnma等[14]对1 087例冷冻复苏第一周期单囊胚移植进行分析，认为滋养细胞与继续妊娠率有关，而内细胞团以及胚胎扩张程度对继续妊娠率没有影响，考虑以后发育为胎盘的滋养细胞在着床过程中起着至关重要的作用，同时胎盘分泌HCG介导母胎界面的免疫抑制，为胚胎的继续发育提供保障，所以滋养细胞质量对临床妊娠有重要的预测作用。Kovacic等[15]对1 396个囊胚和桑椹胚分析发现内细胞团与植入潜能相关性最大，Takahashi等[16-18]也有相似的结论，认为内细胞团将来发育成为胎儿，是妊娠的关键因素，胎儿的异常直接影响滋养层细胞功能以及胚胎发育速度，由此认为内细胞团比滋养细胞层和胚胎扩张程度有更重要的意义。本中心数据显示，1 005周期冷冻复苏第一周期单囊胚移植中，内细胞团、滋养细胞及年龄与临床妊娠率均有相关，囊胚扩张程度与妊娠率没有相关性，这与Kovacic和Takahashi等报道一致。根据胚胎发育天数分为D5和D6，分别对两亚组分析，数据显示在D5单囊胚解冻后内细胞团评分低、年龄大均是临床妊娠结局的独立危险因素，滋养细胞及囊胚扩张程度与妊娠结局无关，D6囊胚解冻移植中妊娠组与非妊娠组的囊胚扩张程度、内细胞团、滋养细胞比较差异均没有统计学意义，说明D6单囊胚妊娠结局除胚胎形态学评分之外仍有其他重要的影响因素，但不排除由于样本量较少而得不到有意义的统计学差异。同时本研究还发现在冷冻复苏第一周期单囊胚移植中，D5囊胚移植的临床妊娠率显著高于D6囊胚，这与李城等[19]的报道一致。

综上所述，第一周期解冻后D5内细胞团评分以及患者年龄升高是影响临床妊娠率的危险因素，其中内细胞团评分低的相对风险值更高，提示我们在进行冷冻复苏单囊胚移植时，对于D5胚胎优先考虑内细胞团质量。

参考文献

[1]Goto S, Kadowaki T, Tanaka S, Hashimoto H, Kokeguchi S, Shiotani M.Prediction of pregnancy rate by blastocyst morphological score and age, based on 1,488 single frozen-thawed blastocyst transfer cycles.Fertil Steril, 2011,95(3):948-952.

[2]Harbottle S, Hughes C, Cutting R, Roberts S, Brison D; Association Of Clinical Embryologists & The (ACE) British Fertility Society (BFS).Elective Single Embryo Transfer: an update to UK Best Practice Guidelines.Hum Fertil (Camb),2015,18(3):165-183.

[3]Ahlström A, Westin C, Reismer E, Wikland M, Hardarson T. Trophectoderm morphology: an important parameter for predicting live birth after single blastocyst transfer.Hum Reprod, 2011,26(12):3289-3296.

[4]Ahlström A, Westin C, Wikland M, Hardarson T. Prediction of live birth in frozen-thawed single blastocyst transfer cycles by pre-freeze and post-thaw morphology.Hum Reprod,2013,28(5):1199-1209.

[5]Parks JC, McCallie BR, Janesch AM, Schoolcraft WB, Katz-Jaffe MG. Blastocyst gene expression correlates with implantation potential.Fertil Steril,2011,95(4):1367-1372.

[6]林海燕，李予，王文军，陈向红，阙文清，陈玉珍，杨冬梓，张清学. 超促排卵周期中获卵数多于20个患者的临床分析. 新医学，2012，43(9)：655-657.

[7]Shapiro BS, Daneshmand ST, Garner FC, Aguirre M, Hudson C, Thomas S.Evidence of impaired endometrial receptivity after ovarian stimulation for in vitro fertilization: a prospective randomized trial comparing fresh and frozen-thawed embryo transfers in high responders.Fertil Steril,2011,96(2):516-518.

[8]Gardner DK, Lane M, Stevens J, Schlenker T, Schoolcraft WB.Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome: towards a single blastocyst transfer.Fertil Steril,2000,73(6):1155-1158.

[9]贾磊，岳超敏，宫晓，方丛，张敏芳，梁晓燕. 移植复苏周期第5日和第6日冻融囊胚发育潜能的比较. 新医学，2013，44(11)：748-751.

[10]岳超敏，方丛，宫晓，李俐琳，李婷婷，梁晓燕．囊胚解冻过夜培养后移植对妊娠结局的影响．中山大学学报( 医学科学版) ，2013，34(3): 415-420．

[11]Ubaldi FM, Capalbo A, Colamaria S, Ferrero S, Maggiulli R, Vajta G, Sapienza F, Cimadomo D, Giuliani M, Gravotta E, Vaiarelli A, Rienzi L.Reduction of multiple pregnancies in the advanced maternal age population after implementation of an elective single embryo transfer policy coupled with enhanced embryo selection: pre- and post-intervention study.Hum Reprod,2015,30(9):2097-2106.

[12]连伟玲，金海霞，孙莹璞，辛志敏，宋文妍．新鲜周期选择性移植单个囊胚对降低多胎妊娠风险的作用．生殖与避孕，2012，32(6): 382-386.

[13]Hill MJ, Richter KS, Heitmann RJ, Graham JR, Tucker MJ, DeCherney AH, Browne PE, Levens ED.Trophectoderm grade predicts outcomes of single-blastocyst transfers.Fertil Steril,2013,99(5):1283-1289.

[14]Honnma H, Baba T, Sasaki M, Hashiba Y, Ohno H, Fukunaga T, Endo T, Saito T, Asada Y.Trophectoderm morphology significantly affects the rates of ongoing pregnancy and miscarriage in frozen-thawed single-blastocyst transfer cycle in vitro fertilization.Fertil Steril,2012,98(2):361-367.

[15]Kovacic B, Vlaisavljevic V, Reljic M, Cizek-Sajko M. Developmental capacity of different morphological types of day 5 human morulae and blastocysts.Reprod Biomed Online,2004,8(6):687-694.

[16]Takahashi T, Igarashi H, Amita H, Hara S, Kurachi H. Cellular and molecular mechanisms of various types of oocyte agingReprod Med Biol,2011,10(4):239-249.

[17]Maheshwari A, Griffiths S, Bhattacharya S. Global variations in the uptake of single embryo transfer.Hum Reprod Update,2011,17(1):107-120.

[18]薛侠,施文浩,师娟子,张四林,赵皖秋,孙宏志,周寒鹰,田莉,刘珊. D5 选择性的单囊胚移植和双囊胚胎移植妊娠结局比较．生殖医学杂志，2014，23 (4): 276-279．

[19]李城，李梅，马水英，吴克良，赵海滨，陈子江. 不同发育天数冻融单囊胚移植的临床结局比较. 现代妇产科进展, 2014, 23(2): 121-123.

(本文编辑：林燕薇)

Effect of blastocyst morphological scoring on clinical pregnancy in single frozen-thawed blastocyst transfer cycles

LiWeiyu,ChenPanyu,FangCong,LiangXiaoyan.

ReproductiveCenter，theSixthAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity，Guangzhou510610，China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the effect of embryo expansion, inner cell mass and trophectoderm quality on clinical pregnancyduringsingle frozen-thawed blastocyst transfer cycles. MethodsA total of 1 005 cycles of single blastocyst transfer were collected for grading of embryo expansion, inner cell mass and trophectoderm scoring.Binary logistic regression was utilized to assess the effect of these morphological scores on clinical pregnancy. ResultsClinical pregnancy rate in the embryo at 5 d aftersingle embryo transfer (D5) was 54.61%, significantly higher compared with 38.49% in the D6 (P<0.01). The age of patients in the D5 transfer group weresignificantly younger than those in the D6 group (P<0.01). Low-inner cell mass scoring and high-age were risk factors of clinical pregnancy in D5 single frozen-thawed balstocyst transfer (OR=1.733，95%CI: 1.213~2.475; OR=0.938, 95%CI: 0.906~0.972，both P<0.001), whereas embryo expansion and trophectoderm were not correlated with clinical pregnancy (both P>0.05). Embryo expansion, inner cell mass and trophectoderm scoringwere not associated with clinical pregnancy in D6 single blastocyst transferbetween pregnant and non-pregnant groups. ConclusionIn D5 frozen-thawed single blastocyst transfer, inner cell mass scoring should be emphasized.

【Key words】Single blastocyst transfer;Frozen-thawed embryo transfer;

(收稿日期：2015-11-20)

Corresponding author，Fang Cong，E-mail: fangconggd@163. com

通讯作者，方丛， E-mail: fangconggd@foxmail.com

基金项目：广东省自然科学基金资助项目(s20130100113404)

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.02.012

·临床研究论著·