异丙肾上腺素联合腹主动脉缩窄术诱导心力衰竭大鼠模型的建立

刘雪琴　蒋洪强　张金国

250100 济南，山东大学医学院(刘雪琴)；272029 济宁，济宁医学院附属医院(蒋洪强，张金国)



异丙肾上腺素联合腹主动脉缩窄术诱导心力衰竭大鼠模型的建立

刘雪琴蒋洪强张金国

250100 济南，山东大学医学院(刘雪琴)；272029 济宁，济宁医学院附属医院(蒋洪强，张金国)

【摘要】目的探讨异丙肾上腺素(ISO)联合腹主动脉缩窄术(AAC)诱导大鼠慢性心力衰竭模型的效果。方法将雄性SD大鼠分为5组，每组20只，分别为假手术、手术、联合A[手术+ISO 1.0 mg/(kg·d)]、联合B[手术+ISO 2.5 mg/(kg·d)]、ISO组[2.5 mg/(kg·d)]。联合A、B术后1周后给予相关剂量的ISO，持续4周，假手术组除不结扎外，余与手术组相同。8周后，UCG监测舒张末期室间隔厚度(IVSd)，左心室舒张末期内径( LVEDd)、左心室后壁厚度(LVPWd)、LVEF，随后处死大鼠，计算左心质量指数(左心室重量/体质量比，LVW/BW)、全心质量指数(心脏重量/体质量比，HW/BW)，制作病理切片，经苏木素-伊红染色观察心肌组织及纤维化程度。结果 与假手术组比较，联合A、B组于术后6周出现尿量下降、呼吸急促、毛色暗淡、活动能力下降等表现，且联合B组死亡率高达85%，其余各组未见明显异常。术后8周联合组IVSd、 LVEDd、LVPWd、LVEF指标与假手术组、手术组、ISO组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。心脏解剖发现联合A、B组HW/BW、LVW/BW明显高于其他各组(P均<0.05)。病理结果显示，联合A、B组心肌细胞体积增大、排列紊乱，间质出血、纤维化明显。结论ISO[1.0 mg/(kg·d)]联合AAC可以在8周内成功建立慢性充血性心力衰竭模型，较单纯AAC或ISO药物造模效果更佳，同时此法简单易行，为心力衰竭模型的制作提供一种新的思路，对心力衰竭机制的研究具有重大的意义。

【关键词】腹主动脉缩窄术；异丙肾上腺素；慢性心力衰竭；大鼠

慢性心力衰竭是各种心脏疾患的最终归宿，也是心内科最常见的死亡原因。根据欧洲心脏病学会最新统计，在欧洲47个国家近10亿的人口中，至少有1 500万慢性心力衰竭患者，还有1 500万无症状的心功能不全患者[1]。美国心脏学会统计，当前美国慢性心力衰竭患者高达580万，每年因心力衰竭而消耗的医疗费用高达390亿美元[2]。在中国34～74岁年龄段，有超过400万的心力衰竭患者，年病死率高达40%，同时心力衰竭的患者不断增加，年增长率已达2.8%[3]。慢性心力衰竭在世界范围内呈现扩大的态势，死亡率不断升高，给家庭乃至社会带来巨大的经济负担。在研究慢性心力衰竭机制过程中，大鼠心力衰竭模型起到十分关键的作用。本研究探讨异丙肾上腺素(ISO)联合腹主动脉缩窄术(AAC)制作大鼠心力衰竭模型的效果，并与既往传统的两种常见模型制作方法比较，现将结果报告如下。

材料与方法

一、材　料

1.实验动物

雄性大鼠100只(SD级，山东鲁抗公司提供)，体质量270～310 g。100只大鼠分为5组，每组20只，分别为假手术、手术、联合A[手术+ISO 1.0 mg/(kg·d)]、联合B[手术+ISO 2.5 mg/(kg·d)]、ISO组[2.5 mg/(kg·d)]。

2.仪器和药物

超声诊断仪；6～12 MHz高频线阵探头；电子天平(0～1 000 g)；10%水合氯醛；青霉素(80万单位/支，山东鲁抗)；异丙肾上腺素(1 mg/支，上海禾丰)。

二、方　法

1.动物模型制备

大鼠术前禁食12 h，称重，采用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧固定于手术台，腹中线周围备皮、消毒、铺巾，切口起自剑突下1 cm，沿腹中线分层切开皮肤、肌肉约2 cm，将盲肠挤出放在浸有生理盐水的无菌纱布，保持湿润。止血钳钝性分离腹主动脉、左肾动脉，于左肾动脉上方约1.5 cm处，穿一条4号手术线，用去尖磨钝的7号针头与腹主动脉平行放置，手术线将两者一同结扎，随后抽出针头，剪掉线头，内脏放回，分层关腹，术后给予腹腔注射青霉素(20万单位/只)，连续3 d，常规喂养[4]。假手术组不结扎腹主动脉，余操作与手术组一样。联合组以及ISO组术后腹腔注射给予相应剂量ISO，连续4周，手术组以及假手术组给予相应剂量的生理盐水。

2.心脏超声动态监测

术后4周开始，每周利用UCG监测大鼠舒张末期室间隔厚度(IVSd)，左心室舒张末期内径(LVEDd)、左心室后壁厚度(LVPWd)、LVEF等指标。

3.取材和病理分析

术后8周，大鼠称重后处死，立即取出心脏，用冷盐水充分清洗心脏，并用滤纸吸干心脏内外的水分后称量，称全心重量(HW)，随后沿室间隔分离左心室，称左心室重量(LVW)，计算心脏重量/体质量比(HW/BW)、左心室重量/体质量比(LVW/BW)。称重后将心肌组织浸泡在多聚甲醛溶液(4%)中，常规固定、脱水、石蜡包埋、切片(厚度5 μm)、苏木素-伊红染色，最后放在显微镜下观察。

三、统计学处理

结果

一、各组小鼠死亡数目以及死亡原因

假手术组2只均死于术后48 h，解剖可见肠梗阻。手术组6只死于3 d内，其中3只死于肠梗阻，3只死于急性心力衰竭。联合A组2只死于麻醉剂量过大，2只死于肠梗阻，2只死于急性心力衰竭，1只死于腹腔感染。联合B组3 d内死亡3只(肠梗阻)，后期注射ISO死亡15只(急性心力衰竭)，死亡率为85%。ISO组4只死于急性心力衰竭。

二、各组小鼠血流动力学指标比较

术后8周联合组IVSd、 LVEDd、LVPWd、LVEF指标与假手术组、手术组、ISO组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)；联合B组与联合A组比较，IVSd、 LVEDd、LVPWd、LVEF差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

注：与假手术组比较，aP<0.01，bP<0.05；与ISO组比较，cP<0.01；与手术组比较，dP<0.01

三、各组小鼠心脏解剖结果比较

联合组心脏质量增大，左心室肥厚明显，同时出现心腔扩大，HW/BW及LVW/BW均明显高于手术组以及ISO组；联合B组与联合A组比较，LVW/BW 明显升高，而HW、BW、HW/BW比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表2。

注：与假手术组比较，aP<0.01，bP<0.05；与联合A组比较，cP<0.01，dP<0.05

四、各组小鼠心肌病理切片结果

联合A、B组心肌细胞体积增大直径增宽，着色不均；可见明显纤维组织，肌纤维间疏松水肿，间隙增宽；手术组以及ISO组心肌细胞轻度增大，血管周围可见轻微纤维组织，见图1。

图1　各组小鼠心肌病理切片形态学检查(苏木素-伊红染色，×100)

讨论

目前复制大鼠心力衰竭的模型种类繁多，主要分为压力超负荷型心力衰竭模型(如AAC)、缺血性心力衰竭模型(如冠状动脉结扎术)、容量超负荷型心力衰竭模型(如动静脉瘘)以及药物心力衰竭模型(如ISO)等[5]。

ISO制作慢性心力衰竭大鼠模型存在着注射部位、剂量、时间等问题，ISO复制心力衰竭模型的作用机制是通过ISO激动心肌β受体，使心肌剧烈收缩、心率加快，增加心肌氧耗，但作用时间相对较短，同时大剂量ISO会引起急性心力衰竭导致死亡，小剂量ISO达不到诱导心力衰竭模型的目的，目前尚无统一的使用剂量指标[6]。本研究ISO组中大鼠LVEDd较正常组低，IVSd、LVPWd以及HW/BW也提示心肌明显肥厚，但心脏功能LVEF反而轻度升高，考虑是心脏代偿性作用。

AAC复制慢性心力衰竭模型的机制是通过缩窄腹主动脉,使心脏后负荷增加,心肌通过神经-体液等机制代偿性增厚，随着后负荷的持续存在，心室容积增大、心脏扩大，最终心肌失代偿形成心力衰竭[7-8]。既往多项研究发现，AAC术后8周出现心肌肥厚，此时心脏处于代偿阶段，未能达到心力衰竭的指标，需要长达12周甚至更长时间达到心力衰竭[9-10]。本研究中手术组大鼠8周LVEDd较假手术组低，IVSd和 LVPWd高，可见心肌肥厚明显，但是LVEF未见明显下降，心脏功能尚处于代偿期，模型未成功。

本研究采用ISO联合AAC诱导大鼠慢性心力衰竭模型，模拟临床慢性心力衰竭的病理变化。通过对比血各组流动力学指标、HW/BW、LVW/BW以及病理切片等，ISO联合AAC方法制作慢性心力衰竭模型较单纯AAC组和ISO组更具有稳定性及有效性，主要机制是在AAC模型的基础上，连续给予ISO刺激心肌β受体，增加心肌收缩力以及收缩频率，促进心力衰竭的进一步发生。联合B组中的大鼠死亡率高达85%，主要是因为ISO的剂量过大导致大鼠发生急性心力衰竭导致死亡，联合组中高剂量ISO并不适合诱导大鼠心力衰竭模型。联合组中低剂量组，大鼠死亡率与ACC、ISO组无明显的差异，血流动力学、心脏超声等均提示慢性心力衰竭的发生，显微镜下可见大量的心肌纤维化，提示心脏功能严重受损，LVEF已达小于45%的国际标准[11]。本方法具有操作简单、死亡率较低、造模效果明确、节省时间等优势，为研究慢性心力衰竭的发病机制和治疗措施提供理想的动物模型。

参考文献

[1]Guha K, McDonagh T. Heart failure epidemiology: European perspective. Curr Cardiol Rev，2013，9(2): 123-127.

[2]Bui AL, Horwich TB, Fonarow GC. Epidemiology and risk profile of heart failure.Nat Rev Cardiol，2011，8(1):30-41.

[3]邢作英，王永霞，朱明军.慢性心力衰竭流行病学研究现状及其病因.中华实用诊断与治疗杂志，2012，26(10):937-938.

[4]石岩，梅世昌.医学动物实验实用手册.北京：中国农业出版社，2002:170．

[5]Huang CC, Monte AA, James M, Cook JM, Kabir MS, Peterson KP. Zebrafish heart failure models for the evaluation of chemical probes and drugs. Assay Drug Dev Technol，2013，11(9-10): 561-572.

[6]Ge T，Qin H，Wang X，Yang SS, Guo L, Han W, Chang HY. Effects of thoracic epidural anesthesia on cardiac function and myocardial cell apoptosis inisoproterenol-induced chronic heart failure rats. J Interv Cardiol，2014，27(5):446-455.

[7]Zhang Y, Li B, Wang B, Zhang J, Wu J, Morgan T. alteration of cardiac ace2/mas expression and cardiac remodelling in rats with aortic constriction. Chin J Physiol，2014，57(6):335-342.

[8]Liu S， Zhao C, Yang C, Li X, Huang H, Liu N, Li S, Wang X, Liu J. Gambogic acid suppresses pressure overload cardiac hypertrophy in rats.Am J Cardiovasc Dis，2013，3(4):227-238.

[9]王瑞芳，何昆仑，杨泉，苗冬梅.压力负荷诱导的大鼠舒张性心力衰竭模型的建立.中华保健医学杂志，2009，11(2):92-95.

[10]Ibrahim M, Kukadia P, Siedlecka U, Cartledge JE, Navaratnarajah M, Tokar S, Van Doorn C, Tsang VT, Gorelik J, Yacoub MH, Terracciano CM.Cardiomyocyte Ca2+handling and structure is regulated by degree and duration of mechanical load variation. J Cell Mol Med，2012，16(12):2910-2918.

[11]Mpe MT, Klug EQ, Silwa KS, Hitzeroth J, Smith DA. Heart Failure Society of South Africa(HeFSSA) perspective on the European Society of Cardiology (ESC) 2012 chronic heart failure guideline.S Afr Med J，2013，103(9 Suppl 2):660-667.

(本文编辑：杨江瑜)

Establishment of heart failure rat model induced by the combination of isoproterenol and abdominal aortic constriction

LiuXueqin,JiangHongqiang,ZhangJinguo.

MedicalCollegeofShandongUniversty,Ji’nan250100,China

【Abstract】ObjectiveTo establish chronic heart failure rat models by the combination of isoproterenol (ISO) and abdominal aortic constriction (AAC) and assess the rat models with relevant data. MethodsOne hundred male SD rats were randomly divided into 5 groups: sham operation, operation, combination A [AAC+ISO 1.0 mg/(kg·d)], combination B [AAC+ISO 2.5 mg/(kg·d)] and ISO groups [2.5 mg/(kg·d)], 20 rats for each group. At postoperative one week, corresponding doses of ISO were administered in two combination groups for consecutive 4 weeks. Except for ligation, the procedures in the sham operation group were similar to those in the other operation groups. At 8 weeks post-operation, echocardiography was performed to measure interventricular septum thickness at end-diastole (IVSd), left ventricular end-systolic dimension (LVEDd), left ventricular posterior wall diastolic (LVPWd) and left ventricular ejection fraction (LVEF). Then, the rats were executed to obtain and calculate the left ventricular weight/body weight ratio (LVW/BW) and heart weight/body weight ratio (HW/BW). H.E staining was performed to observe the morphologic changes and fibrosis degree of myocardial tissue. ResultsCompared with the sham operation group, the rats in the combination A and B groups presented with decreased urine volume, tachypnea, darkening fur color and decreased mobility at 6 weeks post-operation. The death rate in the combination B group was up to 85%. No evident abnormality was noted among the rest groups. At postoperative 8 weeks, IVSd, LVEDd, LVPWd and LVEF in two combination groups significantly differed from those in sham operation, operation and ISO groups(all P<0.05). Cardiac anatomy showed that both LVW/BW and HW/BW in two combination groups were significantly higher than those in the other groups(all P<0.05). Pathological findings demonstrated that cardiac muscle cells were enlarged and irregularly arranged, and interstitial hemorrhage and evident fibrosis were observed. ConclusionsChronic congestive heart failure rat models can be established by the combination of AAC and ISO at a dose of 1.0 mg/(kg·d)within 8 weeks. This modeling method is simple, feasible, and more effective than AAC or ISO alone, providing a novel approach for heart failure modeling and of significance for elucidating the mechanism of heart failure.

【Key words】Abdominal aortic constriction; Isoproterenol; Chronic heart failure; Rat

(收稿日期：2015-09-06)

Corresponding author, Zhang Jinguo, E-mail: cck112000@aliyun.com

通讯作者，张金国，E-mail:cck112000@aliyun.com

基金项目：山东省中医药科学技术研究项目(2013-235)

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.02.006

·基础研究论著·