子宫内膜癌组织中miR-15a的表达变化及其对子宫内膜癌细胞侵袭转移的影响

吴松丽

(三峡大学仁和医院，湖北宜昌443000)



·基础研究·

子宫内膜癌组织中miR-15a的表达变化及其对子宫内膜癌细胞侵袭转移的影响

吴松丽

(三峡大学仁和医院，湖北宜昌443000)

摘要：目的探讨miR-15a在子宫内膜癌组织中的表达及其对子宫内膜癌细胞侵袭转移的影响。方法 选取原发性子宫内膜癌组织及癌旁组织标本79份，利用荧光定量PCR检测组织中miR-15a的表达。将miR-15a模拟物(miR-15a转染组)、无关序列模拟物(非转染组)转染入RL95-2人子宫内膜癌细胞，并设立阴性对照组。利用荧光定量PCR检测RL95-2细胞中miR-15a表达，利用Transwell肿瘤细胞迁移实验和Transwell肿瘤细胞侵袭实验对RL95-2细胞迁移能力和侵袭力进行检测，利用Western blotting法检测RL95-2细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达。结果miR-15a在子宫内膜癌组织中相对表达量(2.37±0.96)显著低于癌旁组织(4.83±1.27)(P<0.05)；miR-15a在子宫内膜癌组织中的表达与FIGO分期、淋巴结转移和远处转移有关(P均<0.05)；miR-15a转染组细胞中miR-15a相对表达量(8.71±2.65)显著高于阴性对照组(3.62±1.97)和未转染组(3.59±1.83)(P均 <0.05)；miR-15a转染组穿膜细胞数显著低于阴性对照组和未转染组(P均<0.05)；miR-15a转染组细胞中MMP-2蛋白相对表达量(1.62±0.59)显著低于阴性对照组(4.57±2.05)和未转染组(4.64±2.17)(P均<0.05)。结论 miR-15a在子宫内膜癌组织中呈低表达，过表达的miR-15a可通过抑制MMP-2蛋白抑制肿瘤细胞的侵袭及转移。

关键词：子宫肿瘤；miR-15a；侵袭；转移；基质金属蛋白酶2

子宫内膜癌是严重危害妇女健康的上皮性恶性肿瘤，占女性生殖道恶性肿瘤的25%～35%[1,2]。微小RNA(miRNAs)是一种内源性小分子RNA，可在转录水平上调控相关基因的表达而实现对生物学功能的调节[3]。研究[4]表明，miRNA不仅调控细胞增殖、生长、凋亡等过程，而且与肿瘤细胞的发生及进展关系密切。miR-15a是miR-15家族重要成员，是一类高度保守的miRNA[5]。有研究[6]指出，miR-15a与恶性肿瘤细胞浸润、转移过程关系密切。2012年10月~2014年10月，本研究观察了miR-15a在子宫内膜癌组织中的表达变化，并探讨其与临床病理特征及肿瘤细胞浸润、转移的关系，以期为临床实践提供基础资料。

1材料与方法

1.1标本、细胞及试剂来源经病理学检查的子宫内膜癌组织及癌旁组织79份，均来自三峡大学仁和医院。根据FIGO 2000分期：Ⅰ期11份、Ⅱ期24份、Ⅲ期29份、Ⅳ期15份；发生远处转移16份。 RL95-2人子宫内膜癌细胞购自上海研域生物工程有限公司，胎牛血清、DMEM培养基和0.25%胰酶均购自美国Gibco公司，总RNA提取试剂盒TRIzol和LipofectamineTM2000细胞转染试剂盒均购自美国Roche公司，miR-15a片段设计及合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，实时荧光定量PCR试剂盒购自南京生兴生物，Cell Counting Kit-8试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，8.0 μm孔径Transwell小室购自北京乐博生物科技有限公司，基质金属蛋白酶2(MMP-2)抗体购自美国Abcam公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG和山羊抗兔(HRP标记)均购自中杉金桥生物公司，实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2子宫内膜癌组织及癌旁组织miR-15a的检测采用荧光定量PCR法。 利用总RNA提取试剂盒提取肿瘤组织、癌旁组织的RNA。利用紫外分光光度仪对提取RNA浓度及纯度进行检测，取A260/A280值≥1.8样品进行PCR。将miR-15a设计成茎环引物进行逆转录合成cDNA：miR-15：5′-GTCGTATC-CAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATFGCACTGGAT-ACGACCACAAACC-3′。以cDNA为模板完成转录，以U6作为内参进行定量PCR测定。miR-15a逆转录引物：上游：5′-TAGCAGCACATAATGGTTTGTG-3′，以试剂盒中的通用引物作为下游引物。PCR反应条件：95 ℃预变性45 s，95 ℃ 10 s，74 ℃ 15 s，反复进行循环36次。每个样品设3个检测复孔进行重复实验。利用2-ΔΔCt法对miR-15a相对表达量进行分析。

1.3RL95-2细胞培养与miR-15a基因转染①将RL95-2细胞株置于DMEM培养基中，放于37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养，细胞呈贴壁增殖，用0.25%胰酶消化、传代，取对数生长的细胞进行转染。②根据LipofectamineTM2000细胞转染试剂盒说明，分别将miR-15a模拟物(miR-15a转染组)、无关序列模拟物(未转染组)转染入RL95-2细胞，并设立阴性对照组，于转染后8 h将所有细胞置于新鲜完全培养基中进行培养。

1.4RL95-2细胞miR-15a表达的检测采用荧光定量PCR法。利用总RNA提取试剂盒提取转染48 h的细胞，其余步骤及结果的计算同1.2。

1.5RL95-2细胞迁移能力的检测采用Transwell肿瘤细胞迁移实验。将培养小室置入24孔板中，取2×105个转染24 h细胞重悬于无血清培养基中，将细胞混合液贴壁放置于小室上层，将含20% FBS的培养基加入到小室下层，于37 ℃、5% CO2条件下进行培养15 h，将小室取出并去除培养基，将上层细胞擦去，用PBS冲洗3次，于室温下用甲醇固定5 min，用0.5%结晶紫进行5 min染色后，用清水浸洗5～8次，倒置晾干后，用刀片将膜取下，封片后于高倍镜下随机选取5个视野对穿膜细胞进行计数。

1.6RL95-2细胞侵袭能力的检测 采用Transwell肿瘤细胞侵袭实验。取保存于-20 ℃的基质胶，于4 ℃条件下过夜融化，在冰上将4 ℃预冷的无血清培养基将基质胶稀释到1 mg/mL。取40 μL稀释后的基质胶包被小室多聚碳酸酯膜的上室面，于37 ℃条件下孵育3～5 h，凝固后备用；取4×105个转染24 h的细胞重悬于无血清培养基中，将细胞混合液加到基质胶上层，将含20% FBS的培养基加到小室下层，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h后将小室取出，擦拭掉上层细胞后，用PBS冲洗3次，室温下用甲醇进行固定后，用结晶紫进行染色，清水浸洗后晾干，封片。于高倍镜下随机选取5个视野对穿膜细胞进行计数。

1.7RL95-2细胞MMP-2蛋白的检测利用Western blotting法。利用蛋白提取试剂盒提取各组细胞总蛋白，用BCA法对蛋白浓度进行检测。取提取总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿转PVDF膜后，用5%脱脂牛奶进行封闭60 min，分别将1∶1 000和1∶20 000稀释的MMP-2及对照蛋白特异性一抗加入，于4 ℃下过夜孵育，用TBST进行漂洗4次，每次4 min，将相应浓度二抗加入后，于室温下静置60 min，再用TBST漂洗4次，每次4 min，加入ECL，于暗室条件下显影，利用Quantity One软件对显影条带进行分析。

2结果

2.1子宫内膜癌及癌旁组织中miR-15a的表达比较miR-15a在子宫内膜癌组织中相对表达量为2.37±0.96、癌旁组织为4.83±1.27，两者比较，t=10.896，P=0.000。

2.2miR-15a在子宫内膜癌组织中的表达与临床病理特征的关系miR-15a在子宫内膜癌组织中的表达与组织学分级和肌层浸润无关(P均>0.05)，与FIGO分期、淋巴结转移和远处转移有关(P均<0.05)，详见表1。

表1　miR-15a表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系±s)

2.3各组miR-15a的相对表达量比较miR-15a转染组细胞中miR-15a相对表达量为8.71±2.65、阴性对照组为3.62±1.97、未转染组为3.59±1.83，三组间比较差异有统计学意义(F=27.165，P<0.05)，miR-15a转染组高于阴性对照组及未转染组(t分别为14.148、14.190，P均<0.05)。

2.4各组细胞迁移力和侵袭力比较miR-15a转染组穿膜细胞数显著低于阴性对照组和未转染组(P均<0.05)，详见表2。

2.5各组MMP-2蛋白表达的比较miR-15a转染

表2　各组细胞迁移力和侵袭力比较(个±s)

注：与未转染组相比，*P<0.05；与阴性对照组相比，#P<0.05。

组细胞中MMP-2蛋白相对表达量为1.62±0.59、阴性对照组为4.57±2.05、未转染组为4.64±2.17，三组间比较差异有统计学意义(F=49.381，P<0.05)； miR-15a转染组低于阴性对照组、未转染组(t分别为10.458、7.747，P均<0.05)。

3讨论

子宫内膜癌是妇科常见恶性肿瘤，早期治疗往往预后良好，但随着肿瘤细胞发生浸润和转移，患者5年生存率显著下降[7]。肿瘤细胞浸润和转移是一个连续的、多步骤的生物学过程，需要多种细胞因子和生长因子共同参与完成[8]，对肿瘤细胞浸润及转移相关机制的研究，有助于为肿瘤的生物治疗提供作用靶位。miR-15a是miRNA重要类型之一，位于人染色体13q14。研究[9]表明，miR-15a是抑癌基因，在多数恶性肿瘤中呈低表达或不表达。本研究显示，miR-15a在子宫内膜癌组织中相对表达量显著低于癌旁组织，进一步与临床病理特征关系分析显示，miR-15a在子宫内膜癌组织中的表达与FIGO高分期、淋巴结转移和远处转移有关,提示miR-15a可能抑制子宫内膜癌细胞转移和浸润。

为进一步研究miR-15a在子宫内膜癌细胞转移和浸润中的作用，采用体外细胞实验的方法，分别对RL95-2细胞转染不同的miR-15a模拟片段，利用Transwell肿瘤细胞迁移实验和Transwell肿瘤细胞侵袭实验[10]对miR-15a不同表达细胞的迁移力和侵袭力进行检测， 结果显示，miR-15a转染组穿膜细胞数显著低于阴性对照组和未转染组，说明miR-15a与子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭力有关，过表达miR-15a可抑制RL95-2细胞体外迁移和侵袭力。

MMP-2作为MMPs家族重要成员，可使细胞外基质中纤维胶原发生裂解；同时，可使骨胶原发生降解，从而加速肿瘤细胞的扩散过程[11]。有研究[12]指出，子宫内膜癌组织中MMP-2蛋白表达量显著升高，且与淋巴转移及组织浸润有关。为进一步探讨miR-15a在抑制肿瘤细胞迁移和侵袭中的可能机制，本研究对不同转染组细胞中MMP-2蛋白表达水平进行检测，结果显示，miR-15a转染组细胞中MMP-2蛋白相对表达量显著低于阴性对照组和未转染组，说明过表达的miR-15a可能通过减少MMP-2蛋白表达而抑制子宫内膜癌细胞的侵袭和转移过程。

综上所述，miR-15a在子宫内膜癌组织中呈低表达，且与FIGO分期、淋巴结转移及远处转移密切相关，过表达的miR-15a可能通过抑制MMP-2显著抑制肿瘤细胞的迁移及侵袭，提示miR-15a在子宫内膜癌中发挥抑癌基因的作用，有望为子宫内膜癌早期发现提供参考及生物学治疗提供新的靶位。

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(收稿日期：2015-08-25)

中图分类号：R737.33

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)01-0024-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.008