JNK信号通路对肝癌小鼠PGE2及CD4+CD25+调节性T细胞表达的影响

蔡沈阳，潘武，冯玺，叶辉

(四川大学华西医院，成都610041)



JNK信号通路对肝癌小鼠PGE2及CD4+CD25+调节性T细胞表达的影响

蔡沈阳，潘武，冯玺，叶辉

(四川大学华西医院，成都610041)

摘要：目的探讨c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路对肝癌小鼠PGE2以及CD4+CD25+调节性T细胞表达的影响。方法 BALB/c小鼠肝癌移植瘤模型分为实验组与对照组，分别用SP600125多肽和生理盐水处理24 d，RT-PCR法检测各组JNK，ELISA法检测PGE2，流式细胞术和免疫组化法分别检测小鼠外周血和肝癌组织中CD4+CD25+调节性T细胞。结果实验组JNK表达低于对照组(0.68±0.03 比0.98±0.17,P<0.05)。实验组组织中PGE2的表达低于对照组[(4.64±0.36)ng/g 比(6.64±1.24)ng/g，P<0.05)]；实验组外周血PGE2的表达低于对照组[(76.57±10.16)pg/mL比(107.88±16.13)pg/mL),P<0.05]；在肝癌组织中，实验组CD4+CD25+调节性T细胞所占百分比低于对照组[(14.37±3.35)% 比(30.90±4.19)%，P<0.05]；在外周血中，实验组CD4+CD25+调节性T细胞所占百分比低于对照组[(3.20±0.12)% 比(4.22±0.32)%)，P<0.01]。 结论 阻断肝癌小鼠JNK信号通路可使PGE2表达下降，进而引起CD4+CD25+调节性T细胞水平降低。

关键词：肝肿瘤；c-Jun氨基末端激酶；前列腺素E2；调节性T细胞

CD4+CD25+调节性T细胞是能够抑制T细胞增殖并同时抑制T细胞产生效应的细胞群，其主动参与免疫应答及免疫耐受的调控，从而直接影响到自身免疫耐受、肿瘤免疫和移植免疫。研究发现，肝癌以及其他多种肿瘤包括头颈部肿瘤、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、恶性黑素瘤、肾癌及胰腺癌等CD4+CD25+调节性T细胞水平较正常人高[1~6]。有学者发现，肿瘤组织中环氧酶2(COX-2)的含量与CD4+CD25+调节性T细胞水平有一定相关性[7~9]。COX-2对肿瘤细胞的作用是通过其催化合成PGE2实现的[10]。肝癌等肿瘤细胞可诱导产生肿瘤来源的PGE2并由此上调CD4+CD25+调节性T细胞的水平，从而产生肿瘤对机体的免疫抑制作用[7~10]。c-Jun氨基末端激酶(JNK)则是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径中最为重要的信号通路。许多研究发现，在肿瘤细胞中有JNK的过度激活, 提示JNK信号通路与肿瘤的发生、发展可能有密切关系[11~13]。 JNK信号通路对于细胞的迁移、增殖、分化、死亡等过程极为重要，由其介导的细胞死亡和补偿性增殖在肝癌的发生中有极重要的作用。本研究旨在探讨在肝癌发生发展过程中，JNK信号通路能否通过调节机体PGE2的表达而改变CD4+CD25+调节性T细胞水平。

1材料与方法

1.1材料动物及细胞株：6~8周龄雌性BALB/c小鼠，SPF级，体质量15~20 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。BALB/c小鼠在四川大学国家重点实验室动物房饲养。小鼠肝癌H22细胞购自中国典型培养物保藏中心。主要试剂：sp600125多肽购自美国MedChemExpress公司；兔抗小鼠叉头蛋白3-T细胞转录因子抗体(Anti-Foxp3)购自加拿大PLlabs公司；FITC Rat Anti-mouse CD4抗体购自美国eBioscince公司；PE Anti-mouse CD25 抗体购自美国eBioscince公司。

1.2肝癌小鼠皮下移植瘤模型制备及分组将H22小鼠肝癌细胞装于5 mL的培养瓶中，计数并调整水平至5×107/mL，用无菌注射器抽取并按107/0.2 mL/只注入BALB/c小鼠腹腔(4只)内，使H22小鼠肝癌细胞在BALB/c小鼠腹腔内继续传代培养。9~11 d后将小鼠脱臼处死，酒精棉擦拭小鼠腹部，无菌解剖剪剪开腹部皮肤暴露腹壁肌肉，无菌镊子挑起腹壁，用2 mL无菌空针刺入腹腔，抽取腹水，用1640培养基稀释至107/mL，取12只BALB/c小鼠，酒精棉擦拭项背部皮肤，用1 mL空针抽取细胞，按2×106/0.2 mL/只接种于小鼠项背部皮下。小鼠4周后均存活，各组小鼠毛色光泽度、饮食、活动以及大小便均正常。处死后解剖检视均成瘤，皮下移植瘤呈圆形或类圆形。12只小鼠进行数字编号，随机平均分为实验组及对照组，实验组小鼠按30 mg/kg每日给予SP600125多肽腹腔内注射；对照组小鼠每日给予相同剂量PBS溶液作为对照。共处理24 d。

1.3血液中PGE2、CD4+CD25+调节性T细胞的检测所有小鼠于第24天通过摘除眼球采血，分别用生化管和装有EDTA-K2抗凝剂采血管收集血液。生化管于3 000 r/min下离心15 min，取上清液置于液氮罐保存，抗凝血置于18~25 ℃保存。①PGE2的检测：采用ELISA法。均按试剂盒步骤进行操作。②CD4+CD25+调节性T细胞百分比的测算：采用流式细胞术。每个标本取100 μL加EDTA抗凝血，离心弃去上清液，按1∶8加入红细胞裂解液(1 mL细胞压积加入8 mL红细胞裂解液)，轻轻吹打均匀，室温避光静置10 min，1 000 r/min离心5 min，弃去上层红色清液，收集沉淀部分，加入1 mL PBS缓冲液洗涤，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，加0.5 mL PBS重悬，加入FITC Rat Anti-mouse CD4 抗体和PE Anti-mouse CD25 抗体，混匀，避光静置约20 min，上流式细胞仪检测。两个均为阳性的即为CD4+CD25+细胞。计算CD4+CD25+调节性T细胞的比例。

1.4肝癌组织中PGE2、JNK mRNA及CD4+CD25+调节性T细胞的检测所有小鼠完整剥离肿瘤组织，将每只小鼠肿瘤组织分为3部分，一部分装入2 mL EP管，置入液氮罐中保存；一部分装入2 mL EP管中，加入1 mL TRIzol后放入液氮罐中保存；另一部分组织用多聚甲醛固定。Foxp3是CD4+CD25+调节性T细胞的特异性、标志性分子，CD4+CD25+调节性T细胞和Foxp3+细胞相关性接近100%，因此可作为CD4+CD25+调节性T细胞的检测标志。①PGE2的检测：采用ELISA法。组织先研磨制成组织匀浆，然后3 500 r/min离心15 min，保留上清液。按试剂盒说明进行操作。②JNK mRNA的检测：采用RT-PCR法。提取总RNA保存于-80 ℃冰箱中。参照基因库基因序列设计引物，由上海生物工程技术有限公司合成。JNK引物片段长度为161 bp：正义链：5′-CTCTCCAGCACCCGTACATCAA-3′；反义链：5′-CTTAGTTCGCTCCTCCAAATCCA-3′。按Promega公司生产的RT-PCR试剂盒说明书进行操作。③Foxp3的检测：采用免疫组化法。取用多聚甲醛固定的组织标本，石蜡包埋，切片。石蜡切片常规脱蜡、入水，采用枸橼酸缓冲液(0.01 mol/L，pH 6.0)微波炉抗原热修复，加正常山羊血清封闭液室温避光孵育20 min。Foxp3检测采用SABC法，即加入一抗孵育后，PBS缓冲液清洗5 min×3次；滴加生物素化第二抗体(IgG)，37 ℃孵育30 min，PBS缓冲液清洗5 min×3次；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，PBS缓冲液清洗5 min×3次；用DAB显色试剂盒显色，蒸馏水洗；苏木素复染、盐酸乙醇分化；脱水、透明、封片、镜检。阳性结果判断：在高倍镜视野下随机观察 5 个视野，Foxp3阳性染色以细胞核染成棕黄色为主，计数肿瘤组织中Foxp3阳性细胞数及淋巴细胞数，计算Foxp3阳性细胞(CD4+CD25+调节性T细胞)占淋巴细胞比例(%)。

2结果

2.1两组JNK mRNA、PGE2水平比较见表1。

表1　两组JNK mRNA、PGE2水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.2两组CD4+CD25+调节性T细胞水平比较实验组外周血中CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞的比例为(3.20±0.12)%，对照组为(4.22±0.32)%，两组比较，P<0.05。在小鼠肝癌组织中，实验组Foxp3阳性细胞(CD4+CD25+调节性T细胞)占肿瘤浸润淋巴细胞的比例为(14.37±3.35)%，对照组为(30.90±4.19)%，两组比较，P<0.01。如图1所示。

注：A图为实验组，B图为对照组(SABC ×400)。

图1阻断JNK信号通路对小鼠肝癌组织

CD4+CD25+调节性T细胞的影响

3讨论

CD4+CD25+调节性T细胞是目前发现的最为重要的免疫抑制细胞，具有免疫抑制性和免疫无能性，在自身免疫性疾病、肿瘤的免疫以及移植耐受等方面具有重要作用。研究发现，肝癌患者无论是外周血还是肿瘤组织中CD4+CD25+调节性T细胞比例显著高于正常人。Yang等[14]通过测量肝癌肿瘤组织和癌旁正常组织CD4+CD25+调节性T细胞水平发现，肿瘤组织中CD4+CD25+调节性T细胞水平较癌旁正常组织明显升高。徐大恒等[7]对肝癌小鼠移植瘤模型的研究发现，移植瘤大小与肝癌组织以及外周血中CD4+CD25+调节性T细胞水平密切相关。这些研究结果提示肝癌患者机体中因CD4+CD25+调节性T细胞增高而导致不同程度的免疫抑制，致使肿瘤组织进展性生长。

抑制机体CD4+CD25+调节性T细胞的表达成为近年肝癌免疫治疗关注的热点。研究表明，PGE2既可以诱导CD4+CD25-转变为CD4+CD25+调节性T细胞并促进其表达特征标记Foxp3，还可以增强CD4+CD25+T细胞的免疫抑制作用[15]。因而，抑制PGE2的产生，可以有效抑制CD4+CD25+调节性T细胞的生成以及功能表达。有研究者使用选择性COX-2抑制剂抑制机体PGE2的产生，致使肝癌小鼠无论是外周血还是肿瘤组织中CD4+CD25+调节性T细胞的表达显著降低[7]。

PGE2是由COX-2催化合成的，不同的刺激因素诱导细胞表达COX-2 的途径不同。细胞应激和致炎因子通常经过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径增加内皮细胞 COX-2 mRNA的稳定性从而上调COX-2 的表达[16]。JNK信号通路是MAPK途径中最为重要的一种， 许多研究发现JNK信号通路在肿瘤细胞中过度激活，与许多肿瘤的发生密切相关。

本研究通过阻断肝癌小鼠JNK信号通路后发现，肝癌组织中以及外周血中PGE2的表达均下降，并且CD4+CD25+调节性T细胞的比例显著降低。推测JNK信号通路可能通过PGE2来调节机体CD4+CD25+调节性T细胞的表达。

肝癌以手术为主的综合治疗效果至今仍不满意，免疫治疗有可能成为一个新的治疗手段。目前的免疫治疗是应用免疫调节剂非特异性地增强机体的免疫功能，激活机体的抗肿瘤免疫应答，但是收效甚微。本实验对小鼠肝癌的研究发现，阻断JNK信号通路可抑制CD4+CD25+调节性T细胞在机体中的表达，使小鼠肝癌的生长受到抑制，这可能为肝癌免疫治疗提供新的靶点。

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Effects of JNK signaling pathway on expression of CD4+CD25+regulatory T cells and PGE2in mice with liver cancer

CAIShenyang,PANWu,FENGXi,YEHui

(WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of c-Jun N-terminal kinases (JNK) signaling pathway on PGE2and CD4+CD25+T regulatory T cells expression of mice with liver cancer. MethodsThe liver cancer xenograft models of BALB/c mice were divided into the experimental group and control group. Mice in each group were treated with SP600125 polypeptides or normal saline respectively for 24 days. RT-PCR was used to detect the expression of JNK pathway signal, ELISA was used to detect the PGE2levels, and flow cytometry and immunohistochemistry were used respectively to detect CD4+CD25+T regulatory T cells levels in the peripheral blood and liver cancer tissues. ResultsThe expression of JNK signaling pathway in the experimental group was lower than that of the control group [(0.68±0.03) vs. (0.98±0.169), P<0.05]. The level of PGE2was lower in the experimental group as compared with that of the control group [(4.64±0.36) ng/g vs. (6.64±1.24) ng/g, P<0.05]. In the periphery blood, PGE2level of the experimental group was lower than that of the control group [(76.57±10.16) pg/ml vs. (107.88±16.13) pg/ml, P<0.05]. In the liver cancer tissues, the percentage of CD4+CD25+T regulatory T cells of the experimental group was decreased as compared with that of the control group [(14.37±3.35)% vs. (30.90±4.19)%, P<0.01]. In the peripheral blood, the percentage of CD4+CD25+T regulatory T cells of the experimental group was lower than that of the control group [(3.20±0.12)% vs. (4.22±0.32)%, P<0.05]. ConclusionWhen JNK signaling pathway was blocked, the expression level was down-regulated, and consequently the levels of CD4+CD25+T regulatory T cells decreased.

Key words:liver neoplasms; c-Jun N-terminal kinases; prostaglandins E2; regulatory T cells

(收稿日期：2015-09-19)

中图分类号：R735.7

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)01-0005-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.002

通信作者简介：叶辉(1963-)，男，教授，主要研究方向为肝胆胰疾病的基础研究与临床诊治。E-mail：doctor1880@163.com

作者简介：第一蔡沈阳(1990-)，男，博士，主要研究方向为肝胆胰疾病的基础研究与临床诊治。E-mail：cai1179@126.com

基金项目：四川省科技支撑计划项目(2013FZ0012)。