坚果果壳色素的纯化和结构解析研究进展

朱若楠，腾可心，王语涵，孙长霞

(1.北京林业大学材料科学与技术学院，北京100083；2.北京林业大学生物科学与技术学院，北京100083；

3.北京林业大学理学院，北京100083)



坚果果壳色素的纯化和结构解析研究进展

朱若楠1，腾可心1，王语涵2，孙长霞3

(1.北京林业大学材料科学与技术学院，北京100083；2.北京林业大学生物科学与技术学院，北京100083；

3.北京林业大学理学院，北京100083)

摘要：色素作为着色剂被广泛应用于食品行业，天然色素色泽自然，对人体无毒副作用，且不少品种兼有营养和药理作用，所以合成色素渐渐被天然色素取代。坚果果壳作为剩余物，往往作为废弃物，既浪费又污染环境。经研究发现，坚果果壳中含有很多活性成分，可以提取出色素作为天然食用色素被应用于奶制品、糕点等食品中，从而做到废弃物的高价值利用。国内在坚果果壳色素的纯化和结构解析研究领域有一定的进展，其中包括膜分离、柱层析、溶剂分离的纯化方法，以及化学、红外光谱、紫外光谱法探究坚果果壳色素结构。

关键词：坚果果壳色素；纯化；结构解析

坚果果壳往往被视为废弃物，但是，有的坚果果壳中含有丰富的天然色素。天然色素的开发与应用己成为各行业科技工作者普遍关注的课题。

不同坚果壳中提取的不同种类的天然色素往往有着不同的功效。例如，山竹果壳色素作为食用天然红色素应用，对于山竹果壳资源充分利用将具有较好的价值和应用前景。且对藤黄球菌、枯草芽孢杆菌、八叠球菌等细菌有着显著的抑制作用[1]；苏芡种壳中含有较多的棕色素，其主要成分为多元酚类物质，多酚类物质具有抗肿瘤、抗氧化以及抗菌等多种生理功能[2]。坚果果壳中的色素经过提取和纯化，可广泛应用于食品、医药等行业。

本文对坚果果壳中的天然色素的纯化及结构解析的方法进行介绍，主要介绍了国内现有研究的最新进展，为坚果果壳的色素纯化和结构解析提供了资料。其中大孔树脂纯化法为众多色素纯化中较常用的方法。使用这些纯化方法近来也带来了巨大的经济效益。是可靠的纯化方法；而色素的结构解析，对探究色素的作用机理起着不可或缺的作用。

1纯化方法

1.1大孔树脂纯化法

大孔吸附树脂的吸附性是由于范德华引力或产生氢键结果，分子筛性是由于其本身多孔性结构的性质所决定。大孔树脂以范德华力从很低浓度的溶液中吸附有机物，其吸附性能主要取决于吸附剂的表面性质，根据树脂的表面性质，可分非极性、中极性和极性三类。大孔树脂的多孔性，使其具有巨大的比表面积，能够依靠和被吸附分子之间的范德华力或氢键进行物理吸附，同时，其多孔性还对分子量大小不同的化合物具有筛分作用。在确定树脂的型号及分离条件时应综合考虑被分离物极性大小、分子量、溶液的pH值等的影响，以及数字化柱的清洗、洗脱液的选择等因素。

刘平[3]对板栗壳棕色素的吸附分离试验进行了研究，结果表明,当pH=5，上样浓度在2.0mg/mL时，吸附流速为1.8mL/min，DA-201树脂对板栗壳棕色素的纯化效果最好；使用80%的乙醇进行洗脱，洗脱速度为0.9mL/min，色素回收率可达75%。展亚莉等[4]对大孔树脂吸附法精制板栗壳天然棕色素试验进行了研究，结果表明：pH为5.5左右，吸附流速为0.5BV，35°C，pH为7.0的乙醇进行解析，xda-6型树脂对板栗壳棕色素的纯化效果最好，得到的解析液减压浓缩即可得到纯化后的棕色素。

姚丽敏等[5]利用大孔树脂对榛子壳棕色素粗提液进行了纯化研究，结果表明:pH=4，样液稀释倍数为25倍，上样体积为110mL,上样流速为1.5～2.0mL/min,AB-8树脂对榛子壳棕色素的纯化效果最好；使用70%乙醇作为棕色素的洗脱剂，洗脱流速为1.5mL/min。王静[6]对榛子壳棕色素的纯化及性质进行了研究，结果表明：当pH=6.0，上样液浓度为2.0mg/mL，上样液溶液吸附流速1.0mL/min，D4020树脂对榛子壳棕色素的纯化效果最好；洗脱剂乙醇浓度为80%，洗脱流速确定为0.5mL/min，洗脱剂乙醇的用量为150mL就可以达到洗脱效果。

魏丽等[7]对向日葵籽壳红色素的纯化进行了研究，结果表明:pH=3,上样液浓度为0.283mg/mL,吸附流速为4mL/min，HPD-400树脂对向日葵籽壳红色素的纯化效果最好；解吸条件为解吸液浓度50%乙醇，pH=2,流速3.0mL/min,经纯化后的色素为紫黑色粉末，其色价为未纯化的2.2倍。王鹏等[8]对葵花籽壳红色素提取纯化进行了研究，结果表明:pH=4，色素液质量分数1%，流速为1.5mL/min,HPD-400树脂对葵花籽壳红色素的纯化效果最好；解吸条件为解吸液质量分数50%，pH=3流速为3.0mL/min。张海悦等[9]对黑葵花籽壳红色素的纯化进行了研究，结果表明：pH=2.5，吸附流速为3.0mL/min，AB-8型树脂对黑葵花籽壳红色素的纯化效果最好；洗脱条件为洗脱剂(乙醇)体积分数为70%，洗脱流速为1.5mL/min,洗脱量为250mL。

大孔树脂的孔径与比表面积都比较大，在树脂内部具有三维空间立体孔结构，所以具有物理化学稳定性高，比表面积大、吸附容量大。大孔树脂的选择性好，吸附速度快，解吸条件温和，再生处理方便，使用周期长使用方便，可重复使用，降低成本。但是大孔树脂种类有限，所以想要选择合适的树脂会受限，而且操作比较复杂。同一型号的大孔树脂不同批次之间的比表面积和功能基团含量差别大。有机残留物高，预处理难度大，给实验增加了难度。大孔树脂强度较差，使用过程中破碎比较严重。因此，如果选择使用大孔树脂纯化色素时，就要充分考虑到其优缺点，根据所纯化物质的性质选择合适的大孔树脂进行实验。

1.2膜分离方法

膜分离技术(Membrane Separation Technology)以选择性透过膜为分离介质，当膜两侧存在某种推动力(如压力差、浓度差、电位差等)时，原料侧组分选择性地透过膜，以达到分离、提纯的目的。膜分离技术以其低能耗、高效率被认为是理想的分离技术之一。由于其兼有分离、浓缩、纯化和精制的功能，又有高效、节能、环保、分子级过滤及过滤过程简单、易于控制等特征，因此，目前已广泛应用于食品、医药、生物、环保、化工、冶金、能源、石油、水处理、电子、仿生等领域，产生了巨大的经济效益和社会效益，已成为当今分离科学中最重要的手段之一。常用的膜分离技术分为超滤膜和纳滤膜分离。

1.2.1超滤法

选用适当孔径的超滤膜，使水分子甚至小分子杂质通过超滤膜，而使溶剂中有效成分被阻留，从而使色素达到某种程度的纯化和高倍数浓缩。超滤膜分离技术作为现代分离技术，因其具有设备简单、能在低温下操作、能耗小、生物活性物质不易失活、效率高等特点，近年来被广泛应用于生物活性物质的分离、浓缩和纯化。国外已经使用超滤膜精制天然色素，我国也有这方面研究。

超滤技术分离效率高，对稀溶液中的微量成分的回收、低浓度溶液的浓缩均非常有效。且超滤过程仅采用压力作为膜分离的动力，因此分离装置简单、流程短、操作简便、易于控制和维护。但是超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。

1.2.2纳滤法

纳滤又称为低压反渗透，是膜分离技术的一种新兴领域，其分离性能介于反渗透和超滤之间，允许一些无机盐和某些溶剂透过膜，从而达到分离的效果。

1.3溶剂分离法

溶剂分离法是根据色素与杂质在不同溶剂中溶解度的差异，由低极性到高级型进行分离提纯，除去杂质。一般包括酸沉淀法、纯沉淀法、重结晶法。

1.3.1醇沉法

醇沉法利用杂质和色素在不同乙醇浓度下溶解度的不同对色素和杂质进行分离。其关键点在于找到乙醇的浓度，过高和过低的乙醇浓度都会造成杂质的又一次溶解。

1.3.2酸沉法

酸沉法是利用不同的pH下色素的溶解度的差异，对含有多酚类色素十分有效。

1.3.3重结晶法

结晶法是利用温度的差异纯化色素。但是结晶法并不容易控制，任何微小的温度差异和波动都会造成结晶的失败。

李永祥等[13]在板栗壳色素提取、纯化和稳定性研究中便采取了以上3种方法 ，并且通过硅胶板薄层层析法鉴定纯化效果，确定出重结晶法和醇沉法获得纯化色素的层析效果没有酸沉法好。重结晶法和醇沉法色素沉淀不彻底 、效率低，且醇沉法较浪费试剂、费用较高；酸沉法色素沉淀彻底、效率高。因此，实际应用中可以先用酸沉法，起到浓缩色素的目的，当色素浓度较高时选用醇沉法，最后选用重结晶法。

1.4硅胶柱层析法

硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离， 一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。

李永祥等[14]对板栗壳棕色素的纯化实验进行研究，优化了色素纯化方法，结果表明:当洗脱剂为30%乙醇、双蒸水、1% NaOH，层析柱大小为1cm×50cm，硅胶为6～100目时，采用硅胶柱层析法，洗脱后得到明显的洗脱峰，表明改良后的纯化方法有效。

硅胶的活度大，容易再生，但在高温下会被破坏失去活性。总之，硅胶柱层析是纯化色素的一种简单有效且经典的方法[15]。

2结构解析方法

2.1化学方法

以物质的化学反应为基础建立起来的分析方法，可进行定性定量分析。当组分含量为1%～100%时可利用化学方法进行分析，分析误差为0.1%～0.2%。

王静[5]在榛子壳棕色素提取纯化及性质研究中通过硼酸显色反应，发现榛子壳棕色素中有5-羟基结构，通过与三氯化铁反应发现榛子壳棕色素黄酮类化合物中含有3-羟基，5-羟基或邻二羟基，又通过荧光反应发现色素中有黄酮体或其甙类物质，由这3个实验初步定性榛子壳棕色素为黄酮类物质。

2.2红外可见光谱法

红外可见光谱法：又称“红外分光光度分析法”。分子吸收光谱的一种。利用物质对红外光区的电磁辐射的选择性吸收来进行结构分析及定性和定量分析的方法。被测物质的分子在红外线照射下，只吸收与其分子振动、转动频率相一致的红外光谱。对红外光谱进行剖析，可对物质进行定性分析。化合物分子中存在着许多原子团，各原子团被激发后，都会产生特征振动，其振动频率也必然反映在红外吸收光谱上。据此可鉴定化合物中各种原子团，也可进行定量分析。具有特征性强、测定快速、不破坏试样、试样用量少、操作简便、能分析各种状态的试样、分析灵敏度较低、定量分析误差较大的特点。

陈晓等[17]在山核桃壳棕色素的生物活性及其红外光谱分析中，利用红外可见光谱法研究山核桃壳棕色素的结构，结果表明：山核桃壳棕色素中含有苯环和酚羟基。张晓云等[2]在苏芡种壳棕色素的提取及红外光谱分析中，利用红外可见光谱发现苏芡种壳中的两种棕色素都存在芳香环，棕色素一中存在酯羰基结构，且具有C-N，而棕色素二中不存在这些结构，但其芳香环上具有棕色素一没有的取代基。

2.3紫外可见光谱法

紫外可见吸收光谱法是利用某些物质的分子吸收10～800nm光谱区的辐射来进行分析测定的方法，这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁，广泛用于有机和无机物质的定性和定量测定。该方法具有灵敏度高、准确度好、选择性优、操作简便、分析速度好等特点。

阎炳宗等[18]在板栗壳棕色素性质的研究中利用紫外光谱法研究了板栗壳棕色素的结构，结果表明：板栗壳棕色素的结构与可可色素的结构类似，都为聚黄酮类。具体操作为：取一定粉末状色素，用蒸馏水配制成0.01%色素水溶液。1cm石英比色皿，以蒸馏水为空白对照，用紫外可见分光光度计，由波长190～900nm进行扫描。

3总结

与人工合成色素相比，绝大多数天然色素对人体无毒副作用，安全性高；很多天然色素中含有人体必须的营养物质，例如，很多天然色素具有活性物质，具有抗氧化性；且有的还有药理作用，对某些疾病有预防作用，所以天然色素渐渐取代合成色素。但是由于天然色素色泽不稳定，在其使用中由于各种因素的影响而发生褪色等现象，这就严重制约了天然色素取代人工色素的进程。坚果果壳色素作为天然色素的一部分，目前国内对于其研究利用还不是很多，尤其是对坚果果壳色素结构的研究非常不完善， 坚果果壳色素的纯化以及结构解析对于坚果果壳色素的开发利用尤为重要。

参考文献

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中图分类号:TS264.4

文献标识码:A

作者简介：朱若楠(1993-)，女，北京林业大学材料科学与技术学院本科生；*通讯作者：孙长霞(1975-)，女，高级实验师，主要从事食品分析与检测方面的研究，E-mail:starsix04@126.com。

基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金项目(YX2015-07)；北京林业大学大学生创新训练项目(X201510022134)

收稿日期：2015-09-30

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2016.01.034