秀丽隐杆线虫在抗衰老领域应用的研究进展

游牧 胡云虎

[摘要]秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）是抗衰老研究中重要的模式生物之一，被广泛应用于抗衰老物质的筛选和抗衰老分子机制的研究中。本文回顾了近年来秀丽隐杆线虫在抗衰老领域应用的研究进展，介绍了抗衰老物质的筛选情况，系统综述了作为抗衰老物质筛选评价的生理指标和反映抗衰老机制的生化指标包括寿命、生存率、生存时间、ROS含量、脂褐质积累以及daf-16，sod-3，gst-4，hsps基因调控情况等，指出了研究中存在的问题，展望了秀丽隐杆线虫在抗衰老研究中的应用前景。

[关键词]抗衰老；秀丽隐杆线虫；生理指标；生化指标

[中图分类号]R339.3+8

[文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2016）02-0104-04

衰老是生物体必然的生理趋势，是一种复杂多变的过程，它和老年病的发生密切相关。延缓衰老可以减少老年病的发生，如动脉粥样硬化、冠心病等，具有重要意义。抗衰老研究往往受困于实验对象选择困难、实验周期过长、样本数有限等问题，也影响抗衰老研究在分子领域的突破。秀丽隐杆线虫（下文简称“秀丽线虫”）是一种非寄生性低等无脊椎生物，因其发育周期明确、时间短；品系资源充足，信息交流便利；易于大规模培养进行大样本量实验消除个体差异；信号通路高度保守等优势被广泛应用于抗衰老药物筛选、环境毒理学等领域的研究。本文综述了以秀丽线虫为动物模型的抗衰老研究现状，为开展相关研究工作提供参考。

1 生理指标

1.1 自然寿命

自然寿命是进行抗衰老研究分析的首选指标。秀丽线虫寿命实验通常采取同步化培养的L4期线虫，放置在涂有实验药物的NGM培养基上，铺板第1天记录为第0天寿命，此后每天显微镜镜检记录线虫的死亡数和存活数。药物中可以添加FUDR抑制线虫产卵，也可以每天更换NGM培养基。20世纪80年代开始使用秀丽线虫筛选抗衰老药物，很多物质如维生素E、黄酮、银杏提取物、白藜芦醇等效果明显。近年研究结果显示，大量人工合成物质或者天然植物提取物也有明显的抗衰老作用。Asthana等研究显示，5μM、25μM和50μM黄金树苷处理均能够延长生命周期，其中25μM效果最为明显，可以延长15.47%。郑善清等使用含有5μM、10μM、50μM、500μM和2000μM绿原酸的培养基处理，多次独立的实验结果表明自然寿命平均能够延长21.3%，50μM处理组效果最佳，平均寿命延长25.2%。王丽萍等利用自主设计合成的抗坏血酸过氧化物酶的新型模拟酶（DhHP-6）给药处理后发现，野生型线虫平均寿命从（16.2±0.53）d提高到（19.7±0.26）d，提高21%。Kim J等报道显示0.5nmM纳米铂处理后野生型线虫平均寿命延长了22.3%、姜黄素、4羟基E环烯醚萜葡萄糖甙（4HEG）、侧柏种子正丁醇提取物（BSPO）、4对羟基苯甲酸（4HBA）、奎尼酸、阿司匹林、葡萄籽原花青素、墨角藻黄素、齐墩果酸、淫羊藿类物质、酪醇（特级初榨橄榄油提取物）、植物适应原（刺五加和红景天的提取物）等也都有类似报道，延长范围一般在15%-25%。文献报道也有一些物质延长的程度更为明显，比如Detienne等利用1.6μg/ml蜂皇乳处理可以使线虫寿命延长33.9%； Vayndorf等研究发现lOmg/ml全苹果提取物可以延长39.6%，最长生存天数提高25%。Zhang等研究发现使用160mg/L浓度MDHB处理后，线虫寿命可以延长40%。寿命实验多使用野生型品系，但也有研究使用fer-15（b26）等其他品系。另外，还有一些物质虽然不能延长正常状态下的线虫寿命，但是在胁迫状态下可以明显延长秀丽线虫的生命周期，如儿茶素（EGCG），茶氨酸，玉米活性提取物四肽、红藻活性物等。

1.2 抗性指标

生命周期的延长通常与机体对外界的抗胁迫能力有关，因此胁迫状态下的生存时间、存活率和ROS产生量都是考察的重要指标。常见的胁迫环境主要有：热胁迫、氧化应激胁迫、细菌感染、uv照射。热胁迫一般在幼虫期就进行药物暴露，发育为成虫后进行热激，热激温度通常为35℃，热激时间lOh左右。已有研究显示，200μg/ml葡萄籽原花青素处理组线虫平均生存时间为19. 6h，显著延长了27.3%：0.1μg/ml EGCG处理后线虫生存率提高13.1%：Asthana等将线虫热激37℃，4h后发现黄金树苷处理组生存率提高了23.89%。

活性氧（ROS）是机体的正常代谢中间产物，ROS过多会造成机体内氧化系统与抗氧化系统的失衡，导致生物大分子的氧化损伤，引起氧化应激的发生，诱导疾病产生，加速衰老。氧化应激实验中通常使用的强氧化剂主要是胡桃醌或百草枯，两者均能迅速使机体产生大量ROS，抗衰老物质大都可以明显清除ROS，提高机体抗氧化损伤能力。Liao等使用250μM胡桃醌刺激，姜黄素处理组ROS含量明显下降。Liu等报道BSPO处理组，在500μM胡桃醌胁迫下有效降低了虫体内ROS含量。Zhang等利用5mM百草枯进行氧化应激胁迫，在胁迫条件下齐墩果酸暴露组ROS水平显著降低。Shukla等使用lOmM百草枯进行氧化胁迫刺激，20μM4HEG处理组的ROS产生减少43%，明显改善线虫体内ROS的积累。相似的结果还出现在EGCG，喹啉类药物，MDHB等物质的研究中。胞内ROS水平目前主要使用分子探针CMH2DCFDA活体检测，可避免研磨组织对ROS检测造成的干扰。氧化应激实验中比较常见的实验对象是野生型，也有研究选用mev-l缺失品系，原因是由于该品系对过氧化物更加敏感，体内氧化自由基增加幅度更大。

细菌胁迫通常使用铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌，Vavndorf等用铜绿假单胞菌PA14感染秀丽线虫，每8-13h检查存活的虫体，结果显示对照组平均存活时间为（82±2.6）h，2.5mg/ml，5mg/ml和lOmg/ml处理组分别为（100±3.8）h， （111±4.4）h和（102±4.4）h，改善效果明显。

uv胁迫是将线虫暴露在紫外线下照射，张健炜等使用L4期线虫，紫外强度为2000J/㎡，50mg/L红茶水提取物处理后可以使线虫的平均存活时间延长20.5%； Wiegant等使用紫外强度为IOOOJ/㎡，结果显示紫外线暴露后线虫的平均寿命由14.6d降低到9.6d，植物适应原处理组降低到11.ld，起到明显的保护作用。此外还有学者制造高糖环境胁迫。目前研究认为抗衰老物质延缓线虫衰老的效果可能是通过改善应激条件下的生存状态，抗衰老物质的效用与其在各种胁迫状态下的保护作用密切相关。

1.3 健康寿命

秀丽线虫中健康寿命指标主要有体长、运动能力（爬行、咽泵、排便）等，脂褐质是近年来出现的健康寿命的新指标。脂褐质又被称为“年龄斑块”，是一种内源性自发荧光物质，主要沉积于神经、心肌、肝脏组织衰老细胞中，是溶酶体消解后的剩余物质形成的残余体。在线虫中，脂褐质只分布在肠道附近，可以通过检查其自发荧光强度来观测。Kim DK等使用40μM 4-HBA处理后，脂褐质积累减少了83.3%； Kim J等研究发现，不同浓度的纳米铂暴露lOd后，0.5mM纳米铂处理组脂褐质积累情况得到有效改善。全苹果提取物、BSPO、中药虎杖提取物等也都具有明显降低脂褐质积累的功效。

2 生化指标

2.1 DAF-16蛋白核质转运

对抗衰老物质的研究除了观察对秀丽线虫生理指标的改善，更多的是分析抗衰老物质的分子调控机制。由于秀丽线虫基因的保守性和同源性，使其具有无可比拟的优势。2008年度诺贝尔化学奖得主Chalfie M[30]以秀丽线虫为实验材料证明了绿色荧光蛋白（GFP）作为发光遗传标记的价值。目前全球线虫资源库中有大量携带GFP的转基因品系，使得对分子机理的研究更为便利和直观。目前已知daf-16基因是哺乳动物FOXO基因的同源基因，是胰岛素途径下游的核心转录因子。正常生理状态下，一系列磷酸化反应使DAF-16蛋白分散在细胞质中。当机体遇到胁迫时，DAF-16蛋白磷酸化水平降低，迁移入核发生核质转运，活化大量抗胁迫基因。该实验常用TJ356（DAF-16∷GFP）品系，对照组在荧光显微镜下通体绿色，发生核质转运后，DAF-16蛋白聚集，虫体出现大量绿色耀眼斑块。Zhang等研究发现，齐墩果酸处理组核质转运比率由6.5%提高到34.8%。Shukla等研究发现20μM 4HEG处理4h后核质转运比率提高到45%。次血红素六肽、酪醇等物质均可以调控DAF-16蛋白核质转运的发生，激活下游抗衰老基因的转录，达到对线虫抗衰老的调控。

2.2 抗氧化酶基因表达

抗氧化酶是维持机体氧化还原平衡的一类酶。机体内一旦形成过氧化物，它们可以把过氧化物转换为毒害较低的物质，进行氧化防御。在报道中比较常见的指标主要是：SOD-3，GST4/7，GSH等。Zhang等研究发现齐墩果酸处理组中SOD3基因表达量明显增加，Asthana等利用CF1553（SO-3∷GFP），CL2166（GST-4∷GFP）品系在25μM黄金树苷暴露72h后检测发现SOD3和GST4的表达量有显著增加；Shukla等挑选野生型成虫在20μM 4-HEG充分暴露后利用QRTPCR技术检测，SOD-3基因的表达量增加了1.4倍。有学者研究发现0.1mg/ml奎尼酸（QA）处理野生型后，其SOD-3的含量大大提升。进一步研究发现当使用daf-16缺失品系CF1038[daf-16（mu86）I]时，QA无法对SOD-3的含量产生影响，而daf-16； daf-2双基因缺失品系中的结果也表现一致，推测药物促进DAF-16蛋白入核，提高了其转录活性，促进了下游基因抗氧化酶基因表达，增加了SOD-3等的表达量，有助于清除ROS。DhHP-6、EGCG、4HBA、玉米四肽、红藻活性物、阿司匹林等都有相似结论。

2.3 热休克蛋白基因表达情况

热休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）是一类结构和功能高度保守的蛋白质。HSP-16.2通常被认为是敏感的抗应激标志物，也是较常见的检测指标。Shukla等使用CL2070[dvls70（HSP-16.2∷GFP）]品系经过4HEG处理后发现HSP-16.2的表达量增加了1.5倍。Liu等将秀丽线虫先35℃热激1h，再20℃恢复24h，荧光酶标仪检测显示100μg/ml BSPO处理组的HSP-16.2∷GFP表达量提高到122.O%。KimDK等处理使用转基因品系HSP-16.2∷GFP，36℃热激2h，20℃恢复4h，发现单纯热激没有提高HSP-16.2的表达量，热激后加入4-HBA表达量大大提高。但Zhang等发现正常情况下奎尼酸不能增加HSP-16.2的产生量，但是热激后可以增加HSP-16.2的产生量。推测是由于HSP-16.2也是daf-16的下游基因，daf-16基因的活化也导致了HSP-16.2表达的增加。阿司匹林、红藻活性物、玉米四肽，黄金树苷、齐墩果酸等也有类似结果。但Wiegant等通过实验分析认为植物适应原的加入没有能够促进HSP-16.2的合成，其合成量远没有热激产生量多。张健炜等研究显示红茶提取物组HSP-16.2∷GFP基因表达水平较正常对照组下调31.7%，认为可能与内质网应激减少有关。

3 展望

目前应用秀丽线虫对抗衰老物质的筛选和抗衰老机制的研究已取得了丰硕的成果，研究工作相对系统全而，大量的抗衰老物质和一些重要信号通路已得到揭示和阐明。但是还有很多细节不明确，很多观点还停留在假说上，缺乏足够的证据予以证实。今后的工作可以采用基因组技术，广泛搜集基因位点，建立数据库并进行比较。此外要避免生理指标对抗衰老评价的偏差，增加客观性和真实性。