电针对APP/PS1小鼠行为学及大脑皮层Klotho基因表达的影响＊

李昱颉，李志刚，王 鑫，曹 瑾，吕 威，宋良玉，景泉凯，高誉姗，张淑静，程 凯＊＊，许安萍＊＊

（1.北京中医药大学针灸推拿学院 北京 100029；2.北京市东城区朝阳门社区卫生服务站北京 100010；3.北京中医药大学基础医学院 北京 100029）

电针对APP/PS1小鼠行为学及大脑皮层Klotho基因表达的影响＊

李昱颉1，李志刚1，王 鑫1，曹 瑾1，吕 威1，宋良玉2，景泉凯1，高誉姗3，张淑静3，程 凯1＊＊，许安萍1＊＊

（1.北京中医药大学针灸推拿学院 北京 100029；2.北京市东城区朝阳门社区卫生服务站北京 100010；3.北京中医药大学基础医学院 北京 100029）

本研究通过观察APP/PS1小鼠大脑皮层Klotho基因的表达及其空间学习记忆能力，探讨电针治疗阿尔兹海默病（AD）的机理。方法：APP/PS1双转基因小鼠，随机分为模型组、电针组（百会穴、印堂穴、人中穴），以C57BL/6野生型小鼠作为对照组；采用Morris水迷宫进行空间记忆行为学测试，以免疫组化法观察皮层Klotho蛋白表达趋势，real-timePCR技术检测大脑皮层Klotho mRNA表达水平。结果：与对照组相比，模型组逃避潜伏时间增加、平台穿越次数、平台象限游泳路程减少；与模型组相比，电针组逃避潜伏时间明显减少。与正常组相比，模型组大脑皮层Klotho mRNA表达减少；与模型组相比，电针组Klotho mRNA表达增加。Real time PCR结果与免疫组化所示表达趋势一致。结论：电针可提高APP/PS1小鼠的空间记忆能力，其机制可能与上调Klotho mRNA表达有关。

阿尔茨海默病 大脑皮层 衰老 电针 Klotho

老年性痴呆又称为阿尔茨海默症（Alzheimer’s Disease，AD）是老年期最常见的神经退行性疾病。AD的病理学改变主要为β淀粉样蛋白和沉积后形成的老年斑（Senile Plaque，SP）和Tau蛋白磷酸化形成的神经纤维缠结[1]。Aβ清除障碍所形成的老年斑堆积是AD发病的主要假说。大量研究表明，Aβ不仅是AD的典型病理产物，也是脑老化的生物学标志物，在正常脑老化过程及很多轻度认知功能损伤的人群中同样存在Aβ，并随着老化逐渐在脑中有沉积加重的趋势[2]，提示脑老化与AD之间存在着很大的相关性[3]。大脑老化作为常态脑老化与AD有共同的病理基础[4]：脑宏观和微观的改变，形态和功能变化、基因突变、相关蛋白变化，导致神经、认知系统功能受损。临床上AD患者的空间记忆能力减退最明显[5]，执行功能、决断力等也相继减退[6]。在老化的进程中，Aβ沉积与海马体积萎缩程度明显相关，主要影响情景记忆[7]；这都提示脑老化是AD神经系统退行性改变的最初阶段，从缓延脑老化进程的角度，研究机体在老化过程中的自我补偿机制，将有利于进一步探讨AD。

“抗衰老基因”Klotho是预防AD的潜在靶点。已有多项研究证实，Klotho基因表达异常与衰老相关[8]，当Klotho基因缺陷可出现一系列与人类衰老相似的多种表现，而通过转基因使Klotho过度表达会减轻衰老症状，延长寿命，提示Klotho基因与衰老相关性疾病有密切联系[9,10]。

Dubal D B等[11]研究表明，对小鼠进行遗传操控使其过度生成Klotho蛋白，小鼠寿命更长，且在血液和海马区域具有更高水平的Klotho[11]。与人体研究相似[12]，Klotho表达增强的小鼠在各种学习和记忆测试中表现更好，与对照组相比，能以更快的速度寻找到迷宫中隐藏目标的位置[13]，认为Klotho过表达有助于提高认知能力。而电针能改善小鼠的学习记忆能力，延缓脑衰老和降低Aβ的水平，是否参与了Klotho机制的调控？

根据以上基础，本文以6月龄APP/PS1双转基因小鼠作为AD模型，采用电针刺激百会穴、印堂穴、人中穴，观察AD模型小鼠认知功能变化，观察电针对大脑皮层Klotho基因表达的影响，以探求电针治疗AD的机理。

1 材料

1.1 模型与分组

1.1.1 实验动物

将6月龄雄性APPswe/PS1dE9双转基因小鼠作为模型组，同月龄C57BL/6野生型小鼠作为对照组。实验动物购自南京大学模式动物研究所，批号：SCXK（宁）2010-000。

1.1.2 分组与电针治疗

将20只APP/PS1双转基因小鼠随机分为模型组（Model，M）和电针组（Electro-Acupuncture，EA），每组10只。以C57BL/6野生型小鼠为对照组（Control，C）。于北京中医药大学动物中心屏障系统单笼饲养，给予足量常规饮食。

电针组：选取百会和印堂，百会穴针尖向后头部、印堂穴针尖向鼻尖方向，进针2-3 mm。采用疏密波，频率1/50 Hz，强度0.3 mA，持续20 min；以针柄震颤，动物不挣扎、不嘶叫为度。电针结束后，电针组小鼠点刺水沟穴，正常组、模型组以相同方法用鼠袋束缚15 min，隔日1次，持续4周。

1.2 主要试剂和仪器

本实验所用试剂包括：兔多克隆Klotho抗体（英国abcam公司，货号：ab154163，批号：1120），抗兔免疫组化试剂盒（浙江迈新科技股份有限公司，货号：KIT-5004，批号：1511109706），Trizol（美国invitrogen公司，货号：15596026，批号：74121）；反转录试剂盒（美国Thermo Scientific Fermentas公司，货号：K1622，批号：00348560）；THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（toyobo-东洋纺上海生物科技有限公司，货号：QPS-201，批号：412200）。主要实验仪器有：韩氏穴位神经刺激仪（北京华卫产业开发公司，型号：LH202H）；一次性使用无菌针灸针（北京中研太和医药有限公司，规格：0.25 mm×13 mm）；紫外分光光度计（英国LNICAM公司，型号：HeλIOSα）、PCR仪（德国Eppendorf公司，型号：Mastercycler Personal）、实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司，型号：CFX96）。

2 方法

2.1 Morris水迷宫检测空间学习记忆

本文采用Morris水迷宫检测各组小鼠空间学习记忆能力。Morris水迷宫按边缘、方向等距离将水池依次分为4个象限。第三象限为目标象限。电针干预4周后的第2-6天进行水迷宫训练，于测试前1天将各组小鼠置于站台上适应环境，以第四象限为入水点让各组每只小鼠在迷宫内自由游泳1 min。实验第1-4天，进行定位航行实验，先将小鼠置于站台上适应10 s，随后依次从4个象限将小鼠面壁放入水中，小鼠登上平台5 s后终止记录时间，最长记录时间为60 s。第5天行空间探索实验，撤除平台，直接将小鼠按象限依次放入。以定位航行实验第四象限为入水点的逃避潜伏时、穿越平台次数和第三象限游泳路程为评判小鼠学习记忆能力的指标。

2.2 样品制备与指标检测

2.2.1 样品制备

水迷宫测试后，每组取4只小鼠，予0.3%戊巴比妥钠（30 mg·kg-1）麻醉，心脏灌注，取全脑用多聚甲醛固定24 h。将多聚甲醛固定的每组4只动物全脑，于乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，做冠状面切片。

水迷宫测试后，另取每组6只小鼠，予0.3%戊巴比妥钠（30 mg·kg-1）麻醉，开颅取皮层，然后置于-80℃冰箱保存。

2.2.2 免疫组化步骤

Klotho免疫组化ABC法：切片脱蜡水化；0.01mol·L-1枸橼酸盐缓冲液热修复抗原10 min；3%甲醇双氧水室温10 min；5%正常羊血清封闭37℃，30 min；一抗（以1∶50稀释）孵育过夜；PBS洗涤。将脑组织置于二抗稀释液中孵育，孵育结束后用PBS漂洗。再用AB复合物于37℃孵育90 min，之后用PBS漂洗。最后用DAB法显色10 min，苏木素复染；脱水、透明、封片。置于光学显微镜下观察拍片。

2.2.3 Real-time PCR步骤

脑组织样本称重，以20倍体积（μg·μL-1）的Trizol匀浆，采取Trizol提取法提取总RNA，用紫外分光光度计测定RNA浓度。按20 μL体系进行逆转录反应。按Real-time PCR体系，加入逆转录产物1 μL、DEPC H2O 8 μL、PCR master mix 10 μL、正反链引物各1 μL，进行PCR实时荧光定量。Klotho扩增引物序列为：5'-ATTGCAGGGTGAATGGTATCT-3'，5'-GCACTG TTATCCCTACCGTATT-3'，内参GAPDH扩增引物序列为：5'-AAATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3'，5'-CAACAATCTCCACTTTGCCACTG-3'。引物由北京鼎国公司合成。采用量2－ΔΔCT法分析mRNA的相对表达量。

3 统计学方法

统计学处理采用SPSS 17.0软件，所有数据均用均数±标准差（±s）表示，Morris水迷宫逃避潜伏期检测数据采用多组重复测量设计资料方差分析；PCR检测用One-Way ANOVA进行分析，多组间比较采用LSD-t检验。P＜0.05认为有统计学差异，P＜0.01表示具有显著统计学差异。

表1 各组小鼠逃避潜伏时间比较/s（±s，n=10）

表1 各组小鼠逃避潜伏时间比较/s（±s，n=10）

注：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05；与相同组别第一天比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别第一天第二天第三天第四天对照组49.96±16.14 30.7±16.35△△30.30±19.70△△32.45±17.11△△模型组56.5±11.06 59.70±0.94**52.74±15.53**48.70±18.37**电针组54.88±16.44 48.70±18.35#48.01±17.27 46.50±19.44△

图1 各组小鼠逃避潜伏时间比较

4 结果

4.1 电针对APP/PS1小鼠空间学习记忆能力的影响

与基线值相比，随着训练天数增加，各组小鼠逃避潜伏时间均缩短（P＜0.05）；与对照组相比，模型组逃避潜伏时间延长；与模型组相比，电针组逃避潜伏时间缩短（见表1、 图1）。

各组空间探索实验穿越平台次数及平台象限游泳距离均用ANOVA分析。与对照组相比，模型组穿越平台次数及平台象限游泳路程明显减少。与模型组相比，电针组穿越平台次数增加（P＜0.05），详见表2。

4.2 电针对APP/PS1小鼠Klotho表达的影响

4.2.1 电针对APP/PS1小鼠Klotho蛋白表达的影响

各组免疫组化图像（图2）可见大脑皮层Klotho表达情况，正常组Klotho细胞内和细胞外均有棕色阳性表达，模型组Klotho表达阳性，但比正常组有明显的减少，仅在细胞内有表达。相对于模型组，电针组的Klotho表达明显增强。

4.2.2 电针对APP/PS1小鼠Klotho mRNA表达的影响

与对照组相比，模型组Klotho mRNA相对表达量明显降低（P＜0.01）；与模型组相比，电针组Klotho mRNA相对表达量增加（P＜0.01）。电针促进了大脑皮层Klotho mRNA表达。详见表3。

5 讨论

有研究显示NMDA受体能与神经元协助形成进一步的加强或弱的连接。NMDA受体能提高大脑细胞的活性和相互交流，对于信息传递具有重要意义，但也是AD等神经退行性病变损伤的靶向位点。Klotho通过调节GluN2B，促进NMDA受体长期开启，接收信息，进而保持细胞间信息交流，从而促进学习和记忆[14]。Klotho诱导的胰岛素抵抗通过减少葡萄糖向脂肪转化，防止细胞内脂质超负荷，从而减少细胞凋亡[15]，研究还发现Klotho表达下降可导致Wnt通路进一步激活，导致干细胞老化，进一步限制组织再生并导致衰老，因此，Klotho参与抑制Wnt通路来抑制衰老[16]。另有学者认为PI3K/Akt信号通路[17]和NF-κB信号通路[18]也参与了Klotho的抗衰老作用。因此推测Klotho在哺乳动物体内是一种抗衰老的激素，其作用涉及多个器官、系统、组织，进一步通过影响多个途径、多种机制发挥其作用。

图2 各组小鼠大脑皮层Klotho的蛋白表达（×400，1∶100）

APPswe/PS1dE9双转基因模型，转入人突变的淀粉样前体蛋白及PS1基因，导致脑内Aβ的水平增高，形成AD一系列病理，主要是以Aβ增多形成老年斑而作为主要病理的一种AD模型[19]。国外研究显示，3月该模型即出现学习记忆能力的减退[20]，而本课题组前期研究结果显示5月龄双转基因小鼠行为学检测差异不明显；而Li X[21]等Morris实验提示该模型的空间记忆障碍于7-8月龄开始出现。本实验中治疗后证明7月龄各组之间行为学有差异，提示7月龄双转基因小鼠已出现空间学习记忆能力的减退。

空间学习记忆能力的减退是AD的主要临床表现，中医认为痴呆病位在脑，有“病变在脑，首取督脉”之说。督脉主一身之阳，是足三阳经与肝经的交会穴。具有醒脑开窍、益气调神的功效，是治疗脑病的要穴；印堂穴位于两眉之间，具有宁心安神、镇惊的作用；水沟穴为手足阳明经与督脉的交会穴，亦可醒神开窍。此三穴配合能起到益智醒脑，发挥治疗痴呆的作用。

表2 各组小鼠穿越平台位置次数、平台象限游泳路程的比较（±s，n=10）

表2 各组小鼠穿越平台位置次数、平台象限游泳路程的比较（±s，n=10）

注：与正常组比较，**P＜0.01，与模型组相比，#P＜0.05。

组别穿越平台位置次数/次平台象限游泳路程/cm对照组2.00±0.66 349.70±115.43模型组0.73±0.46**192.52±93.82**电针组1.08±0.75#222.20±91.40

表3 电针对APP/PS1鼠Klotho mRNA表达的影响（±s，n=6）

表3 电针对APP/PS1鼠Klotho mRNA表达的影响（±s，n=6）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。

组别Klotho mRNA相对表达量对照组5.30±1.90模型组1.30±0.31**电针组2.35±0.52##

本研究的侧重点在于电针对该模型脑内抗衰老基因Klotho的影响。本实验显示电针组的空间学习记忆能力增强，而电针组Klotho表达增加，因此，电针治疗可能通过上调Klotho延缓脑内的衰老，改善学习记忆能力。这可能是电针治疗痴呆的作用途径之一。但电针是否干预了PI3K/AKt通路或NMDA受体等靶点对下游Klotho基因进行调控，其机制需要进一步研究。

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Effects of Electro-Acupuncture on Behavioral Changes, Klotho Level in the Cerebral Cortex in APP/PS1 Transgenic Mice

Li Yujie1, Li Zhigang1, Wang Xin1, Cao Jin1, Lyu Wei1, Song Liangyu2, Jing Quankai1, Gao Yushan3, Zhang Shujing3, Cheng Kai1, Xu Anping1
(1. School of Acupuncture, Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China;
2. ChaoyangmenCommunity Health Service Administration Center of DongchengDistrict, Beijing 100010, ChinaChina;
3. School of Basic Medical Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

This aimed to elucidate the mechanism behind the electro-acupuncture (EA)in treating Alzheimer's disease (AD) by observing Klotho mRNA expression in the cerebral cortex and spacial learning and memory in APP/PS1 transgenic mice. APP/PS1 mice were randomly divided into the model group and the EA group, while C57BL/6wild type mice was taken as the control group. Spacial learning and memory was observed by Morris water maze test. Klotho protein expression in the cerebral cortex was detectedy by immunohistochemistry,while its mRNA levels were quantified by real-time PCR. As a result, the escape latency in the model group increased,the number of crossing and the swimming distance in the model group reduced compared with the control group. The escape latency inthe EA group was shorter than that in the model group. Klotho mRNA expression in thecerebral cortex in the model group were lower than that in the control group, while that in theEA group increased. The outcomes of real-time PCR chimed with those of immunohistochemistry. In conclusion,it was demonstrated that EA treatmentprobably improved the spacial learning and momery of the APP/PS1 transgenic mice by upregulatingKlotho expression in the cerebral cortex.

Alzheimer's disease, cerebral cortex, aging, electro-acupuncture, Klotho

10.11842/wst.2016.08.014

R2-031

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2016-08-01

修回日期：2016-08-20

＊ 国家自然科学基金委青年基金项目（81503654）：逆针灸对老年性痴呆小鼠“抗衰老基因”Klotho的调控，负责人：许安萍；北京中医药大学中青年教师科研类面上项目（2015-JYB-JSMS028）：基于Klotho探讨逆针灸对老年性痴呆小鼠认知能力的保护作用，负责人：许安萍。

＊＊ 通讯作者：程凯，教授，主要研究方向：腧穴特异性研究；许安萍，讲师，主要研究方向：针灸干预中枢神经系统疾病的作用机制研究。