基于“效-毒”相关的Q-marker合理辨识与科学控制＊

孙 蓉，李晓宇，王 亮，徐 男，吕莉莉

（山东省中医药研究院 济南 250014）

基于“效-毒”相关的Q-marker合理辨识与科学控制＊

孙 蓉＊＊，李晓宇，王 亮，徐 男，吕莉莉

（山东省中医药研究院 济南 250014）

有效性、安全性和可控性是药品的三大基本属性且相互联系与依托。中药“效-毒”二重性不仅是中药药性的有机组成部分，属于中药的根本属性；而且因其“多成分、多效应、多靶点、配伍应用、长期用药”等中医药特点，导致中药的可控性极端复杂，单一或多个化学成分检测无论是从质量专属性、活性与功效关联度还是毒性与安全性控制等方面都难以保证中药的质量，再加上基原、产地、采收、贮藏、提取等中药固有因素和炮制与配伍应用等中医习惯用法等方面的影响，致使中药质量控制也因此成为制约中医药现代化、国际化和中医药产业发展的关键因素和技术瓶颈。根据刘昌孝院士提出的中药质量标志物（Q-marker）的概念，本研究选择有毒中药吴茱萸为模式药物，开展基于“效-毒”关联评价的Q-marker合理辨识与科学控制研究，为临床合理、安全用药提供质量控制保证。

“效-毒”相关 质量标志物 合理辨识 科学控制

中药“毒”的记载最早源于《内经》，认为“药即为毒”，药之毒即中药之效。《素问·汤液醪醴论》中认为，“当今之世，必齐毒药攻其中”，中药毒性有“广义”和“狭义”之分，广义毒，一是指药物的偏性，中医利用中药的偏性祛除病邪；二是指药物作用的强弱，既指药物作用大小，又指药物毒性强弱；狭义毒是指药物的毒副作用和毒性反应[1]。后世医宗多论之，“药”“毒”相通的论点，在药性理论的发展中有着较深的影响。而近现代药性理论的著述中所谓之“毒”，则是专指药物对人体的毒害作用的，毒药即指对人体产生毒害作用的药物。现代研究发现，有毒中药的药效物质可能同时也是毒性物质，因此，中药具有“效-毒”二重性的特征[2]。中药药性理论是以功效为核心、以物质为基础，四气、五味、归经、升降浮沉、有毒无毒等要素相互关联的复杂理论[3]，因此，中药“效-毒”二重性也是中药药性的有机组成部分，属于中药的基本属性。

中药因“多成分、多效应、多靶点、配伍应用、长期用药”等特点导致中药的可控性极其复杂，目前的单一或多个化学成分检测，无论是从质量专属性、活性与功效关联度，还是毒性与安全性控制等方面都难以保证中药质量，再加上基原、产地、采收、贮藏、提取等中药固有因素和炮制与配伍应用等中医习惯用法等方面的影响，致使中药质量控制成为制约中医药现代化、国际化和中医药产业发展的关键因素和技术瓶颈。

安全、有效、质量可控是药物的三个基本要素，为解决中医药固有特点和目前存在问题带来的质量控制难题，刘昌孝院士提出了中药质量标志物（Q-marker）的新概念，为中药的质量控制指明了方向[4]。结合中医药理论和中药临床使用特点，我们认为中药Q-marker应从功效和毒性两个方面同时入手，建立基于“效-毒”关联评价的质量标志物（Q-marker）为核心的质量评价体系。

1 基于效-毒关联评价的Q-marker 概念提出

1.1 影响中药质量的因素

中药质量差异大，不合格率高是中药实际存在的普遍问题，进而会严重影响中药的临床疗效，不利于中医药的进一步发展。影响中药质量的因素多样，贯穿其生产加工、流通和使用三个环节，主要影响因素详见图1。生产加工阶段包括药材基源不同导致混伪品存在，药材道地性、种质、生长、土壤重金属、农药残留，经济杠杆下为追求利润最大化导致的药材采收时间不当，加工工艺不合理，炮制不当等影响因素；流通阶段包括贮藏环境，运输条件等影响因素；使用阶段包括提取工艺不当，配伍使用不当和临床汤剂煎煮不当等影响因素。因此，必须要从根源抓起，加强中药材、中药生产加工、流通及使用追溯体系建设，才能切实提高中药质量。

1.2 中药质量控制现状

中药成分复杂，如何有效控制中药的质量是当前中医药面临的关键问题之一。目前的中药质量控制研究采用了多种先进技术，如HPLC-MS、GCMS、指纹图谱技术、代谢组学等组学技术、生物学技术等，对中药的有效成分或有效成分群进行了深入研究，但是功效-质量相关研究较少，与中药实际的临床使用特点和水平脱节，难以真实反映中药的质量。现行的中药质量控制采用的方法多为控制中药中一种或几种指标成分的量，以此来评价中药的优劣，进而实现中药的质量可控。但这种控制方法具有明显的缺陷：一是选择的指标成分是否是药效成分，能否反映药材的总体功效并不明确，具有明显的局限性；二是《中国药典》2015年版中，存在仅控制特征成分及不同中药控制相同特征成分的现象，这些中药功效不同，仅把特征成分当作指标成分的质量控制方法并不合理；三是少量指标成分不能反映中药多成分、多效应、多靶点的作用特点。因此，现行的中药质量评价方法并不能全面评价中药的内在质量，中药内在的质量均一性、有效性、稳定性、重现性无从保证，见图2。

1.3 中药质量控制体系科学构建意义

2015年以来，国务院及多个部门颁布了《中药材保护和发展规划（2015－2020年）》、《关于促进医药产业健康发展的指导意见》，均提出完善质量标准体系建设，健全以《中华人民共和国药典》为核心的国家药品标准体系，完善中药、民族药的药材及药品生产技术规范和质量控制标准，加强中药材、中药生产、流通及使用追溯体系建设，提高中药产品质量和安全水平，增强中药国际标准制定话语权的精神和要求。刘昌孝院士提出的中药质量标志物概念不仅对控制中药质量、保证疗效和药品安全起到了促进作用，而且有利于建立中药全程质量控制及质量溯源体系。中药多成分致使中药材、饮片、提取物、成药质量控制的药效成分指认困难；因此，从功效角度确认中药Q-marker，可提高中药质量控制标准的科学性、合理性和可操作性，也可强化标准的权威性和严肃性，见图3。

1.4 基于效-毒关联评价的Q-marker 概念

中药Q-marker是存在于中药材或饮片、煎剂、提取物、中成药中固有的或加工制备过程中形成的与中药的功效、毒性密切相关的化学物质（群），可作为反映中药质量标示性物质进行质量控制。

图1 中药质量影响因素

图2 中药质量控制现状

图3 中药质量控制体系的构建

中药药性即四气、五味、归经、升降浮沉、有毒无毒等中药性能是中药效毒物质的性能表现；功效是中药药性的功能表达，中药毒性无论其广义内涵还是狭义含义都与中药功效表达和证候背景密不可分。对于无毒中药，可建立功效背景下的Q-maker；对于有毒中药，若毒性成分不是功效成分，则应分别同时建立功效和毒性背景下的Q-marker；若毒性成分是功效成分，则除应建立功效和毒性背景下的Q-marker以外，还应考虑含量限度和“效-毒”平衡问题。因此，中药Q-marker应在“效-毒”关联评价的基础上科学构建。

2 基于“效-毒”关联评价的Q-marker 研究思路

2.1 中药质量的核心内涵

中药材大多来源于自然界的植物或动物，不仅与自然界存在千丝万缕的联系，而且遵循生物遗传和变异规律，在其个体发育过程中形成的化学物质群，都应该是中药质量控制的基本内容；同时中药材经过采收加工、炮制配伍、提取纯化、制剂等过程和体内药物传输后完成物质基础并发挥生物学效应、达到防病治病的目的[5]。传统中医理论认为，中药治病的内在根据是药性即所具有的四气、五味、归经、升降浮沉、有毒无毒等基本特征[6]。中药药性是药材整体化学成分总体属性和生物效应的综合体现，即系统论中的“整体取性”，而绝非单一化学成分的单独作用，任何单一成分不能代替原药材的药性，并且，整体不是各部分简单相加之和。因此，中药质量的核心内涵必须是对中药药性物质基础的种类、含量的定性和定量控制，这不仅是中药传统功效和毒性表征的内在控制因素也是其外在表现形式的基本保证，中药质控形式必须是一种综合、系统、有效、可控的反映中药临床功效和安全可控的完整技术体系，见图4。

2.2 中药质量的过程控制

中药的基源、产地、采收、炮制等固有因素和临床使用过程中的配伍、给药方法等[7]惯用模式都是影响中药质量的重要因素，中药质量控制核心是在精准把握中药药性特点、控制其显性表征的化学物质，即药性物质基础含量、种类的基础上，在饮片、提取物、中成药及标准汤剂里经过病证背景下的功效-毒性相关分析，提出可在特定病证背景下的中药质量标志物（Q-marker）；这样才能确保Q-marker是体现中药材、饮片、单方或复方制剂质量的化学物质，具有一定的溯源性，药材或饮片或提取物Q-marker 基础上通过质量研究确定制剂的中药质量标志物（Q-marker）群，同时这个制剂Q-marker 群应该是一个反映方剂君、臣、佐、使的化学物质组合。

本项目组在前期973课题有毒中药研究过程中，通过进行药性物质基础研究，在系统研究炮制加工、煎煮时间、炮制配伍对效毒物质影响的基础上，对传统药性理论之热性寒性进行评估和预测，建立描述活性物质与毒、效综合效应之间相互关系的数学模型；再通过虚拟筛选发现具有潜在效毒成分，并在证候背景下，运用体内外实验技术，进行了不同水平上的药效学和毒理学验证研究，并通过不同状态下的物质基础辨识，最终确定中药质量标志物（Q-marker）。

3 功效—证候—毒性关联背景下的Q-marker确认与确保疗效与安全性

中药质量控制目前主要集中在有效性控制上，常以中药中一种或者几种有效成分或特征性成分的量作为该中药材或中成药的质量标准。近年来，中药及其制剂药害事件及不良反应报道日渐增多，中药毒副作用的争议直接影响了中药及其制剂的应用和中医药产业化的发展，并形成了成分有毒即药材有毒，药材有毒即复方和制剂有毒的错误认识。中药“效-毒”二重性是中药作用的基本特性，中药毒性是在中医理论指导下，在辨证用药过程中，在功效的临床表征过程中被发现和认识的；中药的毒性与功效和证候密切相关，中药毒性应当放在功效（适应症）和中医的

“证候”中间进行综合评价和科学认知，为此，我们提出“功效-证候-毒性”关联背景下的Q-marker确认，以确保临床用药的疗效与安全性的学术思路，见图5。

3.1 功效—证候—毒性关联背景下的Q-marker确认的必要性

中医的“证候”是指疾病在演变过程中各种病理因素在体质、自然环境、社会心理等因素和多种矛盾综合作用于机体的整体反应，是诊察和思辨所得，为辨证论治提供依据，中药应在 “辨证论治”等中医药理论的指导下使用[8]。以往研究多以“功效-毒性”关联的研究模式进行中药质量标准研究，“功效-毒性”物质基础确认等，忽略了中药“功效”和“毒性”的表达与“证候”的关系。本实验室前期研究显示：吴茱萸挥发油对正常小鼠LD50值为2.70 mL·kg-1·d-1，吴茱萸全组分、醇提组分和水提组分对正常小鼠的MTD分别为15.6 g·kg-1·d-1、70.6 g·kg-1·d-1和80.0 g·kg-1·d-1[9]；吴茱萸挥发油对胃寒证小鼠的LD50值为2.75 mL·kg-1·d-1，吴茱萸水提组分对胃寒证小鼠MTD为160.0 g·kg-1·d-1[10]；亦有学者发现：大黄提取物对CCl4诱导肝损伤大鼠有显著的肝保护作用，而对健康大鼠具有明显的肝脏毒性[11]。因此，对证使用（有毒）中药，可以使毒性得到有效控制。

图4 中药材质量的核心内涵

图5 中药“功效-证候-毒性”关联背景下的Q-marker确认

3.2 “功效-证候-毒性”关联背景下的Q-marker确认的方法研究

适宜于效毒关联评价的证候动物模型建立和中医“证候”客观化、科学化是影响中药“功效-证候-毒性”关联背景下的Q-marker深入研究的一个前提。随着系统生物学技术的进步及网络药理学的发展，利用组学数据，可发现特定疾病中不同证候的系统生物学特征及生物学效应网络，而利用网络药理学技术和方法有助于阐明特定证候的药理学特征[12]。此外，表型组学的提出为中医证候的生物学基础研究提供了新的视角[13]，为证候在动物身上模拟提供了生物学标志。既往我们以整体的病证结合动物模型为主，通过药效学指标评价，证候指标评价及生物学标志物的研究，开展基于中药Q-marker确认的药理学评价体系研究；基于中药Q-marker确认的“效-毒”相关性分析；基于中药Q-marker确认的物质基础研究。在系统药理学基础上，运用系统生物学，网络药理学的方法和技术，综合分析中药“多组分、多靶点、多途径”特征所产生的“效-毒”靶标网络。中药的“效-毒”物质基础可对“效-毒”网络中重合性的生物效应靶点进行调控，从而实现中药“效-毒”靶点网络与“效-毒”物质基础的分子对接。

4 以吴茱萸为例研究基于“效-毒”关联评价的Q-marker

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸、石虎或疏毛吴茱萸干燥的近成熟果实，始载于《神农本草经》，列为中品，具有散寒、止痛、降逆、助阳、止泻的功效。吴茱萸炮制后对吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸内酯含量均下降但不明显，但对柠檬苦素含量影响较大， 提示柠檬苦素可能是毒性物质基础[14,15]。吴茱萸炮制后挥发油含量降低了13.33%，LD50值升高了19.15%，揭示毒性的降低与挥发油组分及含量的变化具有一定的关系[16]。

图6 功效-证候-毒性关联背景下的Q-marker确认方法

我们前期通过HPLC、GC及质谱联用技术，对吴茱萸进行了全息成分表征，通过全息成分与功效、毒性研究数据的关联分析，分别初步确定为功效Q-marker和毒性Q-marker，为后续证候背景下的效毒验证提供化学物质背景信息。

5 吴茱萸“功效-证候-毒性”相关的Q-marker的发现及确定

5.1 实验室前期研究发现

利用胃寒证小鼠模型，采用经典的小鼠热板法，灌胃不同剂量吴茱萸挥发油和水提物，观察吴茱萸挥发油和水提物镇痛及伴随毒副作用，为阐明其“功效-证候-毒性”相关性提供实验依据。检测血清 ALT、AST、PGE2、NO、NOS、MDA、SOD、GSH、GSH-Px、BUN、CR及肝脏 ALT、AST；并通过相关的毒性反应积分表，记录小鼠的伴随毒性症状。吴茱萸挥发油和水提物均在药后 30 min 有明显的镇痛作用，60 min 达到峰效应，呈现一定的“量-效”和“时-效”关系，血中和肝内 ALT 和 AST 水平升高，血中 PGE2、MDA、NO、NOS 水平的增高，SOD、GSH、GSH-Px 水平下降，BUN、CR 水平无明显变化，肝体比值增加，肾体比值无明显变化。吴茱萸挥发油和水提物发挥镇痛效应的机制与抑制疼痛介质释放、过氧化损伤及 NO 损伤有关； 在发挥镇痛效果的同时还会伴随着对肝脏产生一定的毒性，毒性机制主要为氧化损伤，呈现与肝毒性损伤相并行的“量-时-毒”关系[17,18]。

5.2 网络药理学分析

生物碱是吴茱萸的主要化学和生物活性成分，其中吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱是其主要活性成分。使用ChemBio Office 2012软件绘制吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱和β-蒎烯4个代表性化合物的三维立体结构图，将四个化合物三维立体结构投入反向分子对接网站Pharm Mapper，进行药物分子的靶点预测，将筛选得到的靶点通过KEGG数据库及文献查阅得到相应的通路，分析通路找到和镇痛、抗炎和氧化损伤相关的通路，经Cytoscape 2.6软件处理，4个代表性化合物的“效-毒”相关靶点通路预测，得到与吴茱萸镇痛和肝毒性作用同时相关32个靶点及5条通路，体现了吴茱萸质量标志物对“效-毒”网络调控的“多组分、多靶点、多途径”的作用机制（表1）。

图7 中药吴茱萸基于“效-毒”关联评价的Q-marker研究

表1 吴茱萸“效-毒”网络交集通路分析

6 总结与展望

中药质量评价和控制是保证中药临床有效性和安全性的重要前提，也一直是中医药研究的难点和热点，更是制约中药现代化发展的关键科学问题之一。现行的质控格局单一，难以与功效对应，评价模式不能在真正意义上控制中药质量。中药质控需要一种综合、系统、有效、可控的标准去体现中药质量及临床功效。

中药药性是中药效毒物质的性能表现，中药功效是中药药性的功能表达，中药毒性无论其广义毒还是狭义毒都与中药功效表达和证候背景密不可分。因此，中药Q-marker应从功效和毒性两个方面同时入手，建立基于“效-毒”关联评价的质量标志物（Q-marker）为核心的质量评价体系，既能体现中药质量核心内涵，又能实现中药过程控制，功效—证候—毒性关联背景下确认的Q-marker才能确保中药的疗效与使用安全性。

缪希雍谓：“物有味必有其气，有气斯有性。”不仅强调药性由“气”和“味”组成，二者密不可分；又各有偏重，“味”多反映其物质属性，“性”则偏重其功能属性，两者是“体”与“用”的关系，“体用一体，各有偏重”；中药成分复杂即决定了中药性味的多元性特征，且存在密切联系。随着系统化学分离、HPLC-MS、波谱结构确证等技术方法的发展，药性研究及物质基础效毒表征必将实现在物质属性与功能属性层面上的高度统一，再通过分子对接等技术从分子水平阐释药性的物质基础及其表达“效-毒”的原理。因此，中药药性理论不仅是中医药基础理论的重要组成部分和具有指导临床实践的作用，而且证候背景下的功效-毒性关联评价的中药药性物质基础研究才是中药质量标志物确认的前提，也是中药质量评价和控制的突破口。

1 郭兰萍,张燕,朱寿东,等．中药材规范化生产(GAP) 10年: 成果、问题与建议．中国中药杂志, 2014, 39(7): 1143-1151.

2 徐颖,钟恋,刘玉杰,等. 中药饮片炮制规范化研究的思考．时珍国医国药, 2015, 26(2): 355-356．

3 刘昌孝,陈士林,肖小河,等．中药质量标志物(Q-Marker):中药产品质量控制的新概念. 中草药, 2016, 47(9): 1443-1457.

4 李学林,张珊珊,刘瑞新. 试论制剂因素对中药药性的影响. 中医研究, 2014, 24(12): 66-70.

5 张铁军. 中药质量认识与质量评价. 中草药, 2011, 42(1): 1-9.

6 郭世民,马克坚. 中药药性与中药方剂的标准化是中医药标准化发展的基础. 云南中医中药杂志, 2005, 26(6): 11-12.

7 李学林,张珊珊,刘瑞新. 试论制剂因素对中药药性的影响. 中医研究, 2014, 24(12): 66-70.

8 周宜,陈钢,夏丽娜,等. 从《内经》“有故无殒”思想看中药毒性研究.中国中医基础医学杂志, 2007, 13(5): 342-343.

9 黄伟, 赵燕, 孙蓉. 吴茱萸不同组分对小鼠急性毒性试验比较研究.中国药物警戒, 2010, 7(3): 129-134.

10 孙蓉, 黄伟, 尹利顺,等. 吴茱萸不同组分对胃寒证小鼠急性毒性实验比较研究. 中国药物警戒, 2015, 12(1): 11-15.

11 Wang J B, Zhao H P, Zhao Y L, et al. Hepatotoxicity or hepatoprotection Pattern recognition for the paradoxi-cal effect of the Chinese herb Rheum palmatum L. intreating rat liver injury. PLoS One, 2011, 6(9): e24498.

12 谭勇,李健,吕诚,等.有毒中药对证控毒科学内涵的现代诠释.中国中西医结合杂志, 2013, 33(10): 1412-1415.

13 Gerlai R. Phenomics: fiction or the future. TrendsNeurosci, 2002, 25(10): 506-509.

14 张晓凤,刘红玉,谭鹏,等. 炮制对吴茱萸主要成分溶出的影响.解放军药学学报, 2012, 28(2): 133-135.

15 刘湘丹,蔡嘉洛,邹君华,等. 吴茱萸及其炮制品中吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素成分含量对比分析. 中医药导报, 2016, 22(3): 39-41.

16 张晓凤,高南南,刘红玉,等. 吴茱萸炮制前后挥发油成分及毒性的比较研究. 解放军药学学报, 2011, 27(3): 229-232.

17 李晓宇,孙蓉. 基于胃寒证模型的吴茱萸挥发油功效及伴随毒副作用研究. 中国中药杂志, 2015, 40(19): 3838-3844.

18 李晓宇,孙蓉. 基于胃寒证的吴茱萸水提物镇痛及伴随毒副作用机制.中国中药杂志, 2015, 40(14): 2753-2759.

A Research on Reasonable Identification and Scientific Control of Quality marker (Q-marker) Based on Efficacy-Toxicity Correlation

Sun Rong, Li Xiaoyu, Wang Liang, Xu Nan, Lyu Lili
(Shandong Academy of Chinese Medicine, Jinan 250014, China)

Effectiveness, safety, and controllability are three basic properties of drugs and contact and rely on each other. The “efficacy-toxicity” dual character which is the basic attribute of traditional Chinese medicine(TCM) is not only an organic part of TCM medicinal properties, but makes TCM quality control become the key to the development of modernization and internationalization of TCM and its industry factors and technical bottleneck. Because of its "composition, effect, multiple targets, coordinating, long-term medication" and other characteristics in TCM, the controllability is extremely complicated. Single or multiple chemical composition test whether from the quality specificity, activity and efficacy or toxicity and safety control is difficult to guarantee the quality of TCM, combined with the inherent factors of TCM, such as the original, producing area, collecting, storage and extracting, and the influence of the usage of TCM and some other aspects, such as processing and coordinating. According to the Chinese traditional medicine quality markers (Q-marker) concept proposed by Liu Changxiao academician, we selected Evodia Fructus as a model drug, carried out the research on reasonable identification and scientific control of Q-marker based on efficacy-toxicity correlation, a reasonable guarantee for the quality control of clinical reasonable medication safety.

Efficacy-toxicity correlation, quality markers, reasonable identification, scientific control

10.11842/wst.2016.08.002

R917

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-08-19

修回日期：2016-08-20

＊ 科学技术部重点基础研究发展计划“973计划”项目（2009CB522802）：有毒中药的毒性与功效、证候的关系基础研究，负责人：孙蓉；科学技术部“重大新药创制”科技重大专项（2009ZX09502-015）：中药复方药理学研究与药效评价关键技术，负责人：孙蓉；山东省科技厅自主创新和成果转化项目（2014ZZCX02104）：药物安全性评价和适宜于抗肿瘤及缺血性脑血管疾病多靶点和复方新药成药性评价关键技术，负责人：孙蓉；山东省泰山学者工程专项经费资助，特聘专家（ts 201511107）：孙蓉。

＊＊ 通讯作者：孙蓉，博士，研究员，博士生导师，主要研究方向：中药药理毒理与合理用药。