中国地鼠口腔颊囊黏膜癌模型的建立及癌变的动态观察

皇甫冰，庞文彪，张锐虎，郭　 民，高继萍，宋国华*（山西医科大学实验动物中心，实验动物与人类疾病动物模型山西省重点实验室，山西 太原 030001）



中国地鼠口腔颊囊黏膜癌模型的建立及癌变的动态观察

皇甫冰，庞文彪，张锐虎，郭 民，高继萍，宋国华*
（山西医科大学实验动物中心，实验动物与人类疾病动物模型山西省重点实验室，山西 太原 030001）

【摘要】目的： 利用二甲基苯并蒽(DMBA)涂抹法建立中国地鼠颊囊黏膜癌的实验动物模型，观察癌变不同时期的组织学动态变化过程。方法：将60只雄性中国地鼠随机分为3组，分别为模型组(24只)、溶剂对照组(12只)、空白对照组(24只)。溶剂对照组仅涂丙酮液，空白对照组不作任何处理，模型组以0.5% DMBA涂抹中国地鼠两侧颊囊，每周3次，共15周。分别于第6、9、12、15周将模型组和空白对照组随机处死6只，溶剂对照组处死3只，在肉眼及光镜下动态观察颊囊黏膜癌变全过程的形态学和显微组织学改变。结果：与对照组比较，DMBA长时间处理后模型组地鼠相继出现口腔内黏膜充血、增厚、溃烂化脓、白斑及菜花状赘生物等变化，经历了单纯上皮增生(6~9周)、不同程度上皮异常增生(9~12周)、原位癌及鳞状细胞癌(12~15周)等阶段。结论：DMBA涂抹法可成功建立中国地鼠颊囊黏膜癌前病变、鳞状细胞癌模型，发病过程与人类口腔鳞状细胞癌相似，为口腔鳞癌的多阶段、多步骤研究提供了一个较为理想的动物模型。

【关键词】中国地鼠；颊囊黏膜；口腔鳞状细胞癌；二甲基苯并蒽；动物模型

作者信息： 皇甫冰，E-mail：bhuangfu@hotmail.com。*通信作者，宋国华，E-mail：ghsongg@hotmail.com

Development of oral buccal pouch mucosa cancer in Chinese hamsters and dynamic observation of their carcinogenesis

HUANGFU Bing，PANG Wenbiao，ZHANG Ruihu，GUO Min，GAO Jiping，SONG Guohua*
(Laboratory Animal Center, Shanxi Key Laboratory of Experimental Animal Science and Human Disease Animal Model, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi, China)

【ABSTRACT】OBJECTIVE：To observe the dynamic histological changes in dimethylbenzanthracene(DMBA)-induced cancer in the Chinese hamster’s buccal pouch mucosa cancer experimental animal model. METHODS： 60 male Chinese hamsters were randomly divided into three groups：experimental group(24 hamsters)，solvent control group (12 hamsters) and control group(24 hamsters). In the solvent control group，the site was only coated with acetone solution. The buccal pouch mucosas were treated with 0.5% DMBA 3 times a week for 15 weeks. For the experimental and the control groups，6 hamsters were randomly selected and killed after 6 weeks，9 weeks，12 weeks and 15 weeks. For the solvent control group，3 hamsters were killed each time. The morphological and histological changes of buccal pouch mucosa were dynamic observed under naked eye and light microscope. RESULTS：Compared with the control group，a series of abnormal changes was consecutively observed in the experimental group：hyperemia，incrassation，festering Canker，leukoplakia， Cauliflower shape vegetations. The stages of histological changes had the simple hyperplasia(6th-9thweek)，the epithelial dysplasia of different degrees(9th-12thweek)，carcinoma in situ and squamous cell carcinomas (12th-15thweek). CONCLUSION：Our experimental model shows similar changes to that of human oral squamous cell carcinoma. Therefore，the model can be used to study oral squamous cell carcinoma in multi-stage and multi-step dynamic development.

【KEY WORDS】Chinese hamster； buccal pouch mucosa；oral squamous cell carcinoma；dimethylbenzanthracene；animal m odel

口腔癌是全球第6大常见恶性肿瘤，全世界每年估计有27.5万例新增病例和12.8万例死亡人数，已成为一个重要的全球性健康问题[1]。口腔黏膜癌是一种发病率高、浸润和转移较快的黏膜上皮性肿瘤，绝大多数为口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)，目前临床疗效不佳，中期患者预后较差、生存率低[2]，因而有必要建立口腔黏膜癌模型来满足口腔癌的研究需要。基础及临床研究均证实口腔黏膜癌变是一个多阶段、多步骤的动态发展过程[3-6]，但目前仍缺乏更细致全面的癌变动态观察。国内主要有金黄地鼠口腔颊囊黏膜癌前病变及鳞癌等动物模型[7-9]。根据中国地鼠双侧颊囊菲薄，血管丰富，便于牵出的优势，我们采用0.5%二甲基苯并蒽 (9，10-dimethyl-1，2-benzanthracene，DMBA)通过双侧颊囊涂抹的方式建立口腔颊囊黏膜癌前病变及鳞癌中国地鼠模型，对其癌变过程进行动态观察分析，旨在研究口腔癌动态发展的病理形态变化，为探讨口腔癌的发病机制，监测癌前病变恶化及对口腔癌的治疗和预防提供指导。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

清洁级健康雄性中国地鼠60只，由山西医科大学实验动物中心提供(许可证号SCXK晋2015-0001)， 体质量21~25 g，8~10周龄，在干燥、空气流通、24 h 光暗循环条件下饲养。将DMBA(美国Sigma公司)与分析纯丙酮溶液配制成5 g/L的DMBA丙酮溶液。

1.2 分组及HE染色

随机将60只雄性中国地鼠分为3组，分别为模型组(24只)、溶剂对照组(12只)、空白对照组(24只)。每周一、三、五上午9：00用小头棉签在模型组地鼠双侧颊囊涂擦0.5% DMBA丙酮液，用洗耳球吹干并禁食禁水2 h；溶剂对照组仅涂丙酮液；空白对照组不作任何处理。分别于第6、9、12、15周将模型组和空白对照组随机处死6只，溶剂对照组随机处死3只，取口腔一侧完整颊囊黏膜组织于10%的中性福尔马林溶液中固定、脱水、石蜡包埋、切片、HE染色、封片。

1.3 实验观察

1.3.1 肉眼观察 实验中每天观察记录中国地鼠的精神状况、毛色情况及进食饮水量，重点观察口腔内黏膜变化，观察是否出现充血、黏膜增厚、溃烂化脓、白斑及菜花状赘生物等变化。

1.3.2 光镜观察 每例在光镜下观察3个视野，将病理改变按WHO标准的12项分级记录进行判定[10]，分为单纯性上皮增生，异常增生(轻、中、重度)，原位癌和鳞癌。

2 结 果

2.1 中国地鼠基本情况及颊囊形态学改变

空白对照组中国地鼠精神、食欲、灵敏度良好，毛色光滑明亮。实验始末颊囊黏膜未见溃烂及新生物，光滑红润，乳膜下血管清晰可见，与邻近组织无明显差异(图1A)。溶剂对照组形态、质地与空白对照组一致(图1B)。而模型组在DMBA持续作用下中国地鼠变得精神萎靡、食欲不佳、活动迟缓，毛色晦暗粗糙，明显消瘦。在给药第3～4周时，颊囊黏膜出现轻度的充血及水肿；5～6周时黏膜逐渐变粗糙，增厚不明显，黏膜光滑红润，弹性较好，可见黏膜下血管(图1C)；第9周时黏膜明显增厚，在粗糙的基础上出现不规则的糜烂面和浅表溃疡，局部可见有白色斑块病损，涂擦时容易出血(图1D)；12周时表面可见大量粗糙突出的白色斑块病损，糜烂和溃疡增大，部分出现赘生物，探之易出血，黏膜弹性降低(图1E)；第15周时地鼠腮帮肿大，大多数黏膜有赘生物，开始形成黄豆大小的肿块，表面呈菜花状，质地较硬，并不断增大，手术分离黏膜时，极脆易碎。病变颊囊趋于黏连生长，颊囊袋子变小变浅，出现癌性溃疡，中央溃疡，周围有硬结(图1F)。

2.2 中国地鼠颊囊组织病理学改变

正常中国地鼠颊囊黏膜组织病理学上为3～5层细胞组成的复层角化鳞状上皮，上皮和肌层之间为薄层结缔组织，有少量散在的纤维细胞和血管，基底细胞排列整齐，无钉突或钉突不明显。棘细胞层较薄，基底层细胞明显，类似人的正常黏膜。溶剂对照组与空白对照组相同，光镜下组织学表现与正常黏膜一致，无异常改变(图2A和B)。

模型组在第6周时组织病理检查见黏膜上皮粒层和棘层呈团块状增厚，粒层细胞明显。基底细胞层增厚，细胞形态正常，基底膜仍整齐清晰。黏膜下散在炎性细胞浸润，一些血管充血及有血细胞渗出。极少数颊囊黏膜表现为非典型性增生，钉突形成(图2C)。

在第9周时多数上皮角化层增厚，呈过度正角化，少数错角化。上皮层次不明显，黏膜上皮粒层和棘层细胞明显增厚，基底细胞增生呈明显复层样改变，多数基底细胞极性消失，但基底膜清楚未见破坏，上皮钉突增宽，呈钉状和乳头状。上皮细胞体积变大，细胞形态不一，胞浆丰富，核浆比例倒置，细胞核浓染，嗜碱性增强。黏膜下层有中度炎性浸润，浆细胞浸润。镜下偶见上皮萎缩，固有层呈明显炎症细胞反应，为溃疡组织学表现(图2D和E)。

A：空白对照组；B：溶剂对照组；C：模型组第6周；D：模型组第9周；E：模型组第12周；F：模型组第15周.图1 中国地鼠颊囊黏膜癌变的大体观察

第12周时上皮明显增生，分层紊乱，过角化、错角化严重，有些部分形成“V字形过角化”，棘细胞层出现单个或成团细胞角化。基底层细胞增厚，异常增生的细胞累及上皮2/3以上，大量细胞极向消失，排列紊乱。上皮细胞间附着减弱或消失，细胞间距增大，偶见上皮裂隙，形态大小不一，上皮细胞核欠规则，染色质边集，核大深染，核浆比例改变，有丝分裂相增加。固有层可见大量炎性细胞浸润。上皮钉突肥大延伸呈足状和水滴状，但基底膜仍完整，未侵入黏膜下层，呈中重度异常增生改变。嗜碱性增强。少数非典型增生累及上皮全层，滴状钉突形成并有“滴脱落”现象，为原位癌(图2F和G)。

第15周时上皮细胞与胞核呈明显多形性表现，上皮增殖并突破基底膜侵入固有层及结缔组织内，可见数个肿瘤岛，伴随初期角化和非典型的核分裂，核仁增大，呈高分化鳞状细胞癌和接近肌层的浸润癌(图2H)。

A：空白对照组；B：溶剂对照组；C：模型组第6周；D：模型组第9周；E：模型组第9周；F：模型组第12周；G：模型组第12周；H：模型组第15周.图2 中国地鼠颊囊黏膜癌变的组织病理学观察(HE染色，×200)

3 讨 论

口腔鳞状细胞癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，大约占口腔颌面部恶性肿瘤的90%，手术、放化疗是主要治疗方式，但预后不佳[11-13]。口腔鳞状细胞癌手术治疗带来的咀嚼、吞咽、语言等功能障碍及容貌畸形，严重影响患者的术后生存质量，术后5年生存率通常在60%左右，晚期患者仅20%~40%[14-15]。充分认识口腔鳞癌发生、发展的分子机制，寻找早期诊断指标，特别是进行口腔鳞状细胞癌不同分化程度的诊断和针对性治疗，成为了头颈部鳞癌研究中的热点与难点。

颊黏膜鳞癌是一类侵袭性较强、复发率较高的恶性肿瘤，是我国的常见恶性肿瘤，但相关报道比较有限[16-17]。人颊黏膜鳞状细胞癌变过程是由正常口腔黏膜上皮—黏膜上皮单纯增生—黏膜上皮异常增生—口腔鳞癌的连续动态变化过程[18-19]。本实验用DMBA成功地诱发了中国地鼠颊囊黏膜癌，经组织学观察相似于人类颊黏膜鳞状细胞癌。目前暂无有关DMBA诱导中国地鼠颊囊黏膜癌的报道。中国地鼠较以往实验常用的金黄地鼠生命力更强、易于饲养；个体较小，易于单手操作；两侧颊囊容易牵引翻脱、血管丰富，是微循环研究、免疫学研究和肿瘤移植的理想直观部位，肿瘤易于观察和切取，是实验肿瘤学的理想实验动物[20]； 口腔黏膜与人类十分相似，可模拟人类口腔癌变过程。因此可作为口腔黏膜癌模型研究，该动物模型的建立有助于我们对口腔癌变这一发生、发展过程进行更为详细的多阶段、多步骤的动态观察。

本研究用DMBA涂擦中国地鼠颊囊黏膜建立的口腔颊黏膜癌前病变和鳞癌模型作为研究对象，通过定期处死动物，分别从肉眼下和光镜下两方面动态观察了中国地鼠口腔颊囊黏膜癌变的全过程。实验结果显示，在肉眼下中国地鼠颊囊黏膜在15周中经历了正常—充血、糜烂、化脓—增厚、粗糙—白斑样改变—菜花状新生物的动态过程。在DMBA的连续作用下，口腔颊囊黏膜的弹性缓慢下降，黏膜粗糙性、厚度、糜烂面、溃疡面及白色斑块等严重程度均呈稳定性增长，颊囊黏膜与周围组织分界不清，并最终出现恶性病变。光镜下对 DMBA 涂擦中国地鼠颊囊黏膜的显微组织学观察表明：依次经过正常上皮细胞—单纯增生—异常增生(轻度—中度—重度)—原位癌—浸润癌的序列变化。按WHO癌前病变的判断标准[6]，6周时主要为单纯性上皮增生，9周时呈轻度上皮异常增生和中度上皮异常增生，12周时呈中度上皮异常增生，部分出现原位癌，15周时已发生癌变，癌细胞突破基底膜侵入固有层及结缔组织内。在实验开始1~6周内，上皮细胞的形态呈相对稳定状态，改变不明显，在9周以后逐渐出现不典型增生，并逐渐严重发展为癌。因此，本次实验建模成功，癌变过程的连续动态观察为口腔颊黏膜癌前病变的早期诊断提供参考，为下一步从转录水平探索口腔黏膜癌变的发病机制和寻找更科学合理有效的肿瘤标志物奠定基础，为口腔黏膜癌变的治疗和预后提供有益的方法和思路。

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基金项目：山西省实验动物专项(2014k08，2015k03)

收稿日期：2015-09-25；

修订日期：2015-12-01

中图分类号：R73-3

文献标志码：A

文章编号：1004-616X(2016)01-0056-05

doi:1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.01.012