miR-34a在新疆维吾尔族和汉族妇女不同宫颈病变组织中的表达及临床意义

方　 芳，王　 静，马彩玲*（新疆医科大学第一附属医院妇科，新疆 乌鲁木齐　 830054）



miR-34a在新疆维吾尔族和汉族妇女不同宫颈病变组织中的表达及临床意义

方 芳，王 静，马彩玲*
（新疆医科大学第一附属医院妇科，新疆 乌鲁木齐 830054）

【摘要】目的： 检测miR-34a在新疆维吾尔族和汉族妇女不同宫颈病变组织中的表达情况，并探讨其与宫颈癌临床病理指标的关系及其临床意义。方法：采用实时荧光定量PCR检测58例宫颈癌、60例宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅱ~Ⅲ级和32例健康对照组织中miR-34a的表达，分析其在维吾尔族、汉族妇女不同宫颈病变中的表达差异及与宫颈癌临床病理指标的关系，绘制受试者工作曲线(ROC)分析miR-34a作为宫颈癌肿瘤标记的诊断价值。结果：miR-34a在维吾尔族和汉族妇女宫颈癌组织中的表达均显著低于CINⅡ~Ⅲ级和健康对照组织(P<0.05)，同类宫颈病变组织维吾尔族和汉族妇女间表达差异无统计学意义(P>0.05)。miR-34a的表达与肿瘤直径、FIGO分期、淋巴结转移显著相关(P<0.01)，与年龄、肿瘤分化程度、病理类型等无显著相关(P>0.05)。miR-34区分宫颈癌与健康者、CINⅡ~Ⅲ级患者时，曲线下面积(AUC)分别为0.889(灵敏度87.5%，特异度81.0%)和0.767(灵敏度78.3%，特异度70.7%)，从所有受试者中区分出宫颈癌患者的AUC为0.810(灵敏度83.7%，特异度70.7%)。结论：miR-34a参与宫颈癌的发生发展，在宫颈癌组织中表达明显下调，且无种族表达差异，可能成为宫颈癌诊断及病情预测的新型分子标记。

【关键词】miR-34a；宫颈癌；临床特征；ROC曲线；维吾尔族

作者信息：方 芳，E-mail：15459122@qq.com。*通信作者，马彩玲，E-mail：h ymcl@sina.com

Expression of miR-34a in different types of cervical lesions from Uyghur and Han women in Xinjiang and its clinical significance

FANG Fang，WANG Jing，MA Cailing*
(Department of Gynecology, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang, China)

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To investigate the expression of miR-34a in different types of cervical lesions from Uyghur and Han women in Xinjiang，and to explore its association with clinicopathologic parameters of cervical carcinoma and its clinical value. METHODS：Quantitative real-time PCR was used to detect miR-34a expression in 58 specimens of cervical carcinoma，60 specimens of cervical intraepithelial neoplasia Ⅱ-Ⅲ level (CINⅡ-Ⅲ level)and 32 specimens of healthy control tissue. Data were used to analyze correlations between the expression levels of miR-34a in cervical lesions to different degrees of Uyghur and Han women and related clinicopathologic parameters of cervical carcinoma. Receiver operating characteristic curve (ROC curve) were used to analyze the ability of potential biomarkers to determine cervical carcinoma. RESULTS：The expression of miR-34a in cervical carcinoma was statistically significantly lower than those in CINⅡ-Ⅲ level and healthy control tissue (P<0.05)，but no obvious difference was detected between women with Uyghur and Han ethnicities (P>0.05). The expression of miR-34a was associated with the tumor size and FIGO stage and lymph node metastasis (P<0.01). No significant associations were found between miR-34a level and other clinicopathologic parameters of cervical carcinoma，such as age，differentiation，pathological types (P>0.05). miR-34a yielded a receiver-operator characteristic curve area(AUC) of 0.889 (sensitivity 87.5% and specificity 81.0%) to discriminating cervical carcinoma patients from healthy controls and 0.767 (sensitivity 78.3% and specificity 70.7%) to discriminating patients with cervical carcinoma from CINⅡ-Ⅲ level patients and 0.810 (sensitivity 83.7% and specificity 70.7%) to determining cervical carcinoma from all cases. CONCLUSION：Expression of miR-34a was similar for thedifferent ethnic groups. Down-regulation of miR-34a may be involved in the oncogenesis and development of cervical carcinoma. T herefore，miR-34a may b e u seful a s a novel biomarker for early diagnosis and prognosis monitoring.

【KEY WORDS】miR-34a；cervical carcinoma；clinicopathologic features；receiver operating characteristic curve；Uyghur

宫颈癌(cervical carcinogenesis，CC)是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，世界范围内，宫颈癌发病率居女性生殖系统恶性肿瘤第1位，死亡率居女性恶性肿瘤第2位[1]。我国宫颈癌发病率居世界第2位，新疆为我国宫颈癌高发地区，维吾尔族妇女的病死率居各民族之首[2]。宫颈癌恶性程度高、易转移侵袭，预后差。早期常无明显症状和体征，易漏诊和误诊。因此，探索宫颈癌发生发展机制，寻求灵敏度高和特异性强的肿瘤标记物对于宫颈癌的早期诊断、分期鉴别、靶向治疗、病情监测及预后评估等具有重要意义。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类具有高度保守性、时序性和特异性的非编码单链小分子RNA，长度约18~25个核苷酸，在转录后水平调控蛋白编码基因，参与肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡等过程，作为癌基因或抑癌基因影响肿瘤的发生发展[3-5]。miR-34a定位于人类染色体1p36.23，直接受经典抑癌基因p53调控，参与p53信号通路，在肿瘤组织细胞中易缺失或失活，与结肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生发展密切相关[6]。目前miR-34a与宫颈癌的关系报道甚少，其在新疆维吾尔族和汉族间表达差异关系的研究未见报道。为此，本研究运用实时荧光定量PCR技术(quantitative real-time PCR，qPCR)检测miR-34a在新疆维吾尔族和汉族妇女不同宫颈病变组织中的表达情况，初步探讨miR-34a在不同宫颈病变组织中的差异表达，及其与宫颈癌临床病理指标的关系和对宫颈癌诊断的应用价值。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集2010年11月-2013年2月期间在新疆医科大学第一附属医院妇科住院手术治疗并经术后病理确诊的维吾尔族和汉族妇女不同宫颈病变石蜡组织标本，排除急性炎症或严重慢性疾病患者，妊娠哺乳妇女，接受过放化疗、局部药物及其他治疗者。由本院两名病理科医生独立阅片复核后最终纳入150例，其中宫颈癌58例(为根治性全子宫切除术及盆腔淋巴结清扫术者标本)，宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅱ~Ⅲ级60例，健康对照组32例(因子宫肌瘤行子宫全切术的正常宫颈组织)。宫颈癌组维吾尔族25例，汉族33例，年龄32~79岁，中位年龄50.0岁；CIN组维吾尔族26例，汉族34例，年龄28~75岁，中位年龄44.0岁；健康对照组维吾尔族15例，汉族17例，年龄30~71岁，中位年龄40.5岁。各组间及组内维吾尔族和汉族病例之间年龄差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器 miRNeasy FFPE试剂盒、miScript II 反转录试剂盒、miScript SYBR Green PCR Kit实时荧光定量PCR试剂盒均购自德国QIAGEN公司。miR-34a及内参U6引物序列由上海生工公司合成。RGQ-5PLEX HRM实时荧光定量PCR 仪为德国QIAGEN公司产品，NanoDrop2000分光光度计为Thermo公司产品。

1.2.2 组织总RNA提取及检测 按照miRNeasy FFPE试剂盒说明书步骤提取石蜡组织总RNA， NanoDrop 2000分光光度计测定RNA吸光度D(260)及D(280)值，计算浓度和纯度，D(260)/D(280)比值为1.8~2.0可用于逆转录。1%琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA完整性。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测组织miRNA 应用miScriptⅡ反转录试剂盒将RNA逆转录合成cDNA，反应体系20 μL，反应条件为37 ℃、60 min，95 ℃、5 min，-20℃保存。1∶30稀释cDNA，以U6为内参，按照miScript SYBR Green PCR试剂盒说明书，配置20 μL反应体系：cDNA 1 μL，2×SYBR Green Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，无核酸水7 μL。miR-34a引物序：上游5´-TGCGCTGGCAGTGTCTTAGCT-3´，下游5´-CC AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3´；U6引物序列：上游5´-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3´，下游5´-AAATAT GGAACGCTTCACGA-3´。荧光定量PCR反应条件为：95 ℃预变性15 min；94 ℃变性15 s、55 ℃退火30 s、70 ℃延伸30 s，40个循环；在70 ℃收集荧光信号，循环结束后60~95 ℃绘制熔解曲线。每个样本检测均重复3次，设空白对照。绘制扩增曲线，记录每个反应管中的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数即CT值 ，采用相对-定量比较CT法 ：-△△CT=(CT，实验组目的基因-CT，实验组内参基因)-( CT，对照组目的基因-CT，对照组内参基因)，计算出miR-34a基因相对表达量=2－△△CT。

1.2.4 绘制受试者工作曲线 以敏感度为纵坐标，(1-特异性)为横坐标绘制受试者工作曲线(receiver operator characteristic，ROC)，计算曲线下面积(areaunder curve，AUC)，并根据最大Youden指数选择miR-34a作为肿瘤标记物的临界值。分析miR-34a用于诊断宫颈癌的灵敏度和特异度，灵敏度、特异度越高，曲线下面积越大，诊断准确性越高。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计处理。miR-34a 相对表达量资料呈偏态分布，采用中位数M与四分位数间距(QL~QU) 表示。不同宫颈病变独立样本组间比较及宫颈癌临床病理指标组间比较采用非参数检验，Spearman秩相关性分析研究相关性，以α=0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 miR-34a在不同宫颈病变组织中的表达

miR-34a在维吾尔族和汉族妇女不同宫颈病变组织中的表达见表1。miR-34a在宫颈癌组中的表达量明显低于CINⅡ~Ⅲ组及健康对照组，表现为健康对照组> CINⅡ~Ⅲ组>宫颈癌组的逐渐下降趋势，3组间表达差异具有统计学意义(χ2=25.123；χ2= 25.801，P=

维吾尔族汉族0.000)，进一步两两比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。同一种宫颈病变组织中，维吾尔族与汉族miR-34a表达差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 miR-34a在不同宫颈病变组织中的表达

2.2 miR-34a表达水平与宫颈癌临床病理指标的关系

miR-34a的表达与宫颈癌临床病理指标的关系见表2。miR-34a表达水平与患者年龄、肿瘤分化程度、病理类型、肌层浸润、宫旁浸润均无关(P>0.05)，但与肿瘤直径、FIGO分期、淋巴结转移有关(P<0.01)。miR-34a表达量在肿瘤直径>4 cm者中明显低于肿瘤直径≤4 cm者，表达差异具有统计学意义(Z=-3.115，P=0.002)。比较不同FIGO分期患者，Ⅲ~Ⅳ期患者miR-34a表达量较Ⅰ期及Ⅱ期患者明显下调，差异具有统计学意义(χ2=15.160，P=0.001)。与无淋巴结转移者相比，有淋巴结转移者miR-34a明显低表达，差异有统计学意义(Z=-2.797，P=0.005)。进一步进行Spearman秩相关性分析，miR-34a表达水平与肿瘤直径呈负相关(r=-0.413，P=0.001)，与FIGO分期负相关(r=-0.491，P=0.000)，与淋巴结转移负相关(r=-0.370，P=0.004)。

2.3 miR-34a检测在宫颈癌诊断中的价值

ROC曲线分析显示miR-34a区分宫颈癌与健康者的AUC为0.889(95%CI：0.814~0.957，P=0.000)，以miR-34a 表达量0.406为评价临界值，灵敏度87.5%，特异度81.0%(图1A)；将宫颈癌从所有受试者中区分出来的AUC为0.810(95%CI：0.737~0.882，P=0.000)，以miR-34a表达量0.211为临界值，灵敏度83.7%，特异度70.7%(图1B)，表现出较高的诊断价值。而区分宫颈癌与CINⅡ~Ⅲ患者的AUC为0.767(95%CI：0.680~0.854， P=0.000)，以miR-34a表达量0.211为临界值，灵敏度78.3%，特异度70.7%，诊断价值中等(图1C)。

表2 miR-34a的表达与宫颈癌临床病理指标的关系

A：miR-34a作为标记区分宫颈癌与健康者的ROC曲线；B：miR-34a作为标记从所有受试者中区分出宫颈癌的ROC曲线；C：miR-34a作为标记区分宫颈癌与CINⅡ~Ⅲ级患者的ROC曲线.图1 miR-34a作为肿瘤标记诊断不同宫颈病变的ROC曲线

3 讨 论

宫颈癌为女性常见恶性肿瘤，近年来发病率逐渐上升并呈年轻化趋势。目前宫颈癌的治疗仍以手术为主，放化疗为辅，宫颈癌易转移复发，5年生存率，早期癌90%，晚期仅为66%[7]。宫颈癌是多因素、多步骤及长期作用的结果，因此，探究宫颈癌发生发展机制对于疾病的早期诊治，提高患者生存率极其重要。miRNA是目前肿瘤研究的热点领域，成熟miRNA形成RNA诱导沉默复合物RISC，与下游特定靶基因mRNA碱基互补配对，抑制蛋白翻译，参与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、转移和侵袭等，在肿瘤的不同进展阶段具有不同的表达谱，可作为肿瘤标记物进行早期诊断及判断预后等[8-10]。

miR-34a最早在秀丽隐杆线虫中发现，是进化保守miR-34家族中的一员。业已公认，经典抑癌基因p53的突变或缺失与人类恶性肿瘤的发生发展密切相关。对乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤等多种恶性肿瘤的研究发现miR-34a基因序列上游约30 kb的启动子区域存在高度保守的p53蛋白结合位点，决定了p53对miR-34a的直接诱导转录，同时受miR-34a的正反馈调控作用。研究报道，p53基因调控CDK4、CDK6、c-myc、C-MET、CyclinE2、Bcl-2等蛋白[11-13]。E2F基因组为转录调节因子，在细胞周期的G1/S期转变过程发挥重要作用，miR-34a可直接靶向结合p53-miR-34a-E2F3-p53通路中E2F3基因3´UTR，下调E2F3表达上调p53，正反馈激活miR-34a表达，抑制细胞增殖[14-15]。miR-34a靶向抑制沉默信号调节子1，活化p53表达，形成p53-miR-34a-SIRT1-p53正反馈通路，增强放大miR-34a自身及p53作用，促进细胞周期G1期阻滞及细胞衰老凋亡[16]。miR-34a的失活或缺失可能与肿瘤的发病机制有关。Osawa等[17]研究发现，miR-34a在胃癌前病变-早期胃癌-进展期胃癌中呈动态升高趋势，miR-34a在胃癌组织中高表达，可作为胃癌的预后判断指标。

为探讨miR-34a在宫颈癌组织中的表达，本研究应用实时荧光定量PCR技术检测了维吾尔族和汉族不同宫颈病变组织中miR-34a的表达水平，结果显示维吾尔族及汉族妇女宫颈癌组织中miR-34a的表达均显著低于健康对照组织及CINⅡ~Ⅲ级组织(P<0.01)，并随健康对照组、CINⅡ~Ⅲ级、宫颈癌病变级别的升高呈动态下降趋势。miR-34a低表达与宫颈癌恶性程度显著相关，肿瘤直径越大、FIGO分期级别越高、有淋巴结转移者，恶性程度越高，miR-34a表达量越低。提示miR-34a可能作为抑癌基因参与宫颈癌形成的早期事件，miR-34a的低表达可能削弱了对肿瘤细胞周期进展及凋亡的控制，导致肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，初步揭示了miR-34a在宫颈癌发生发展中的作用。临床中，宫颈原位癌及微小浸润癌可无明显病灶，宫颈活检存在取材局限，漏诊可能，检测miR-34a表达量可能作为癌前病变及早期宫颈癌的监测指标，以提高早期诊断率。miR-34a随宫颈癌恶性程度改变而呈现表达水平的变化，可能为宫颈癌靶向治疗提供新的策略和良好的预后判断指标。在本研究结果中，miR-34a的表达与临床分期相关，与宫旁浸润无关，一方面考虑与样本量较少，存在样本偏倚可能，另一方面宫旁浸润为临床分期的重要指标，但浸润区域范围，有无肾盂积水或膀胱直肠黏膜转移等也与宫颈癌的临床分期相关，考虑可能为多因素共同影响miR-34a在不同临床分期中的表达差异，而单一宫旁浸润表达差异无统计学意义，可待后期进一步研究。

Andersen等[18]采用qPCR技术对恶性胸膜间皮瘤(MPM)患者和正常人组织样本中miR-145检测，提出miR-145可作为筛查MPM的生物标记。本研究在检测miR-34a表达水平的基础上，进一步ROC曲线分析发现，miR-34a区分宫颈癌与健康者时灵敏度87.5%， 特异性81.0%，从所有受试人群中区分宫颈癌时，灵敏度83.7%，特异性70.7%，均表现出较高的诊断价值，提示miR-34a具有作为肿瘤标记的潜力。

新疆维吾尔族妇女宫颈癌高发，本研究比较了维吾尔族妇女与汉族妇女miR-34a表达水平，结果显示表达无种族差异(P>0.05)，表明维吾尔族宫颈癌高发与miR-34a表达水平无关，可能与种族间的基因多态性显著差异引起遗传易感有关[19]，有待研究。此外，流行病学研究指出维吾尔族特有的生活习性、较低的经济水平和肿瘤预防意识淡薄等社会因素也与其高发病率有关[2]。

综上所示，miR-34a在宫颈癌中低表达，参与宫颈癌的发生发展，可能成为宫颈癌诊断及病情预测的分子标记。本研究为回顾性研究，利用FFPE样本作miRNA表达谱分析具有很好的准确性和实用性[20]，因而我们选取较易获取的FFEP标本进行了本实验，初步揭示了miR-34a在宫颈癌组织中的差异表达，为后续扩大样本量，进一步从蛋白水平分析宫颈病变组织表达差异及相关作用机制等研究奠定了基础。

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基金项目：国家自然科学基金资助项目(81160278)

收稿日期：2015-11-05；

修订日期：2015-12-16

中图分类号：R737.3

文献标志码：A

文章编号：1004-616X(2016)01-0041-05

doi:1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.01.009