Caspase细胞凋亡通路在鱼类中的研究进展

张在鹏，冯建军

(集美大学水产学院，鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，农业部东海海水健康养殖重点实验室，福建厦门 361021)

Caspase细胞凋亡通路在鱼类中的研究进展

张在鹏，冯建军*

(集美大学水产学院，鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，农业部东海海水健康养殖重点实验室，福建厦门 361021)

摘要介绍了Caspase概念与分类及其在哺乳动物中的研究情况，综述了鱼类Caspases基因的组织表达、在胚胎发育中的表达、在应激状态下的表达变化及鱼类Caspases分子的蛋白功能研究进展，并展望了鱼类Caspases今后的研究方向。

关键词细胞凋亡；半胱氨酸蛋白酶；硬骨鱼类

细胞凋亡是程序性的细胞死亡过程，具有独特的形态学和生化特征，并受多种因素调节。Caspase属于细胞内大量分布的半胱氨酸蛋白酶家族，能够将细胞外信号传递到细胞内最终引起细胞凋亡，在细胞免疫过程中发挥重要作用。目前，哺乳动物Caspases在细胞凋亡中的结构、调节和功能方面的研究已相当深入，但有关鱼类Caspases基因家族的研究尚薄弱。近年来，鱼类细胞凋亡的研究越来越受到关注，Caspases基因家族在部分硬骨鱼类上已有一些报道。鉴于此，笔者参考国内外的最新报道，综述了鱼类Caspases基因家族的研究进展，以期为Caspase的进一步研究提供参考。

1Caspase介绍

细胞凋亡是多细胞生物调节自身生长、发育和免疫反应的基本生物学进程。Caspase属于半胱氨酸蛋白酶家族，在细胞凋亡过程中发挥重要作用。Caspase可分为炎症相关Caspases(1、4、5、13)和细胞凋亡相关Caspases(2、3、6、10)。根据其在凋亡信号通路中的作用，细胞凋亡相关Caspases又可分为起始Caspases(2、8、9、10)和效应Caspases(3、6、7)[1-2]。细胞凋亡相关的Caspases在鱼类各组织中广泛表达，其中在免疫相关的组织中表达量相对较高。鱼类的胚胎发育过程涉及众多细胞凋亡现象，而Caspases在其机体组织分化、器官发育以及自稳态维持等方面起关键作用。

2哺乳动物Caspases的研究

通常，哺乳动物Caspases在细胞中以无活性的酶原形式存在。一般来说，Caspases基因家族都具有相同的结构域：N-端前结构域、大亚基(P20域)和小亚基(P10域)[3]。起始Caspase具有1个较大的N-端前结构域包括：蛋白接头功能域、Caspase募集域(CARD)或者能够募集转接蛋白以激活下游效应Caspases的死亡效应域(DEDs)。而效应Caspases通常只有很短的N-端前结构域，无明显的蛋白接头[4-6]。根据凋亡信号的传导方式将哺乳动物细胞的凋亡分为内在和外在凋亡路径[7-8]。外在凋亡通路是由细胞膜表面的死亡受体蛋白调节的，而内在凋亡通路则是由内源信号触发的[9]。外在凋亡通路中，当细胞外凋亡信号与细胞膜上的受体结合后，信号被传递到细胞内的起始Caspase-8、10，之后信号传导至效应阶段的Caspase-3、6、7。而内在凋亡通路则是由线粒体引起的，首先线粒体中的凋亡信号传导至起始Caspase-9，随后传导至Caspase-3、6、7，最后进入凋亡执行阶段。人类Caspase-9是内在凋亡路径上关键的起始Caspase，其在信号传递时形成一个凋亡复合体，负责传递由线粒体发出的内在凋亡信号[8，10]。随即凋亡复合体分裂为一大一小2个亚基，该2个亚基通过“自吸”的方式形成二聚体，Caspase-9被激活，进而活化下游的Caspase-3和Caspase-7，使凋亡信号传递到执行阶段[11-12]。研究表明，外在和内在的凋亡路径都会导致Caspase-3激活，在细胞凋亡通路上执行阶段起关键作用[13]。

3鱼类Caspases基因的组织表达

目前，主要从mRNA水平研究鱼类Caspases基因在各组织中的表达情况。鱼类Caspases一般在血细胞、鳃、肝脏以及脾脏中表达量较高，在其他组织也有组成性表达，提示Caspases凋亡通路在鱼类中的生物学功能具有多样性[14-15]。鱼类在水环境中生长，鳃直接与外界环境接触，是病原菌入侵的首要部位，肝脏和脾脏是鱼类主要的免疫器官，而血淋巴则是天然免疫反应中的重要介质，Caspases基因在这些免疫相关组织中高丰度表达表明Caspase信号通路与鱼类免疫应答反应密切相关[16-18]。

4鱼类Caspases基因在胚胎发育中的表达研究

多细胞生物中，细胞凋亡在其组织分化、器官发育和机体稳态维持中有着重要意义。机体在产生新生细胞的同时，通过凋亡机制有针对性地清除衰老和突变的细胞，从而使机体各组织和器官正常发育和代谢。斑马鱼作为模式动物，其胚胎发育过程是研究鱼类细胞凋亡机制的理想模式[19]。Yamashita等[20]发现斑马鱼胚胎发育过程中，pro-Caspase-3基因的过表达可引起斑马鱼胚胎眼、脊索和心脏系统的不正常发育，表明pro-Caspase-3在早期胚胎发育的多进程调节中发挥重要作用。Yabu等[21]研究了胁迫状态下斑马鱼胚胎发育情况，结果显示在热休克39 ℃和紫外照射条件下，斑马鱼胚胎发生大规模的细胞凋亡，Caspase-3的活性数倍增加，并具有剂量依赖性，表明caspase-3-like在胁迫条件下的细胞凋亡中发挥重要作用。

5鱼类Caspases基因在应激状态下的表达变化

细胞凋亡与免疫调节有着密切联系。当细胞受到外界如辐射、缺氧、高温、病原感染等刺激后，产生的信号通过细胞膜上的相应受体传入细胞，引起细胞脂质过氧化或是诱导细胞凋亡有关的基因表达，通过一系列生化反应最终引起细胞凋亡。

水产养殖业长期受到病害的困扰，造成了严重的经济损失。因此，关于水产动物病害防御免疫机制的研究受到广泛关注。目前，有关鱼类Caspases基因参与免疫反应的相关研究已有报道。Laing等[22]从虹鳟(Oncorhynchusmykiss)中克隆了Caspase-6基因，发现Caspase-6在不同组织均有表达。虽然单独使用LPS或皮质醇刺激白细胞后未能引起Caspase-6表达量变化，但先用皮质醇处理后再进行LPS刺激，则发现Caspase-6基因表达水平显著升高，推测Caspase-6可能参与了虹鳟的免疫反应。Reis等[23-24]检测到Caspase-3和Caspase-8基因在天然舌齿鲈(Dicentrarchuslabrax)体内表达水平较低，当发光杆菌感染后Caspase-3、8的表达量均有不同程度的升高。大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)经poly I：C及细菌刺激后，头、肾、脾脏中Caspase-3以及脾脏和肾脏Caspase-9基因的表达量均有显著升高，表明poly I：C和细菌可能激活了大黄鱼的内在细胞凋亡途径[25-26]。金头鲷(Sparusaurata)经鳗弧菌感染后，Caspase-1基因在相关免疫组织中表达水平持续上升[27]。

近年来，有关温度胁迫对Caspases基因表达影响的研究也有报道。Takle等[28]用20 ℃高温处理虹鳟胚胎后，Caspase-7表达量在54 h后达到峰值，而Caspase-6表达仅能在热处理后的胚胎心脏中检测到。章琼等[29]在对团头鲂(Megahbramaamblycephala)进行氨氮胁迫研究时发现Caspase-9基因在肝脏和脑中的表达量均出现上调，表明该基因可能参与了团头鲂的免疫防御机制，而且与细胞凋亡分子过程有关。大黄鱼中的相关研究结果显示Caspase-1基因在10和15 ℃胁迫后，肝脏和心脏中的相对表达量显著上升，而经过25和30 ℃胁迫后Caspase-1的表达量降低，其在心脏中的降低尤为显著。大黄鱼肝脏中Caspase-7表达量在低温时升高，而肾脏中Caspase-7表达量在低温和高温条件下均显著降低[30]。

6鱼类Caspases分子的蛋白功能研究

哺乳动物Caspases不但与细胞的凋亡关系密切，而且还参与了细胞的生长、分化等方面的调节。哺乳动物中Caspases的功能研究已经相当透彻，但鱼类中其研究尚处于探索阶段。Mu等[25]通过构建重组表达载体获得了大黄鱼Caspase-9的融合蛋白，并对蛋白中活性位点突变对蛋白活性的影响进行了研究，结果显示Caspase-9蛋白的水解活性是actin蛋白的56.21倍，而His249突变为天冬氨酸或者Cys299突变为甘氨酸后两者的水解活性分别只有actin的4.88和3.08倍。Leu228突变后的水解活性是actin的53.63倍，并未引起水解活性的改变，表明组氨酸和半胱氨酸活性位点对维持大黄鱼caspase-9的活性都是必需的，而半胱氨酸活性位点比组氨酸活性位点更重要。Elvitigala等[31]获得的大黄鱼Caspase-3重组融合蛋白能够水解哺乳动物Caspase-3/7/8/9特定的底物，与水解Caspase-8/9底物时表现出的活性相比，其水解Caspase-3/7底物时表现出明显的特异性，证实了大黄鱼Caspase-3具有类似于哺乳动物Caspase-3基因的功能。Banerjee等[32]研究了嗜水气单胞菌(A.hydrophila)引起蟾胡鲇(Clariasbatrachus)头肾巨噬细胞的凋亡过程，其免疫印迹法结果显示Caspase-3参与并介导了头肾巨噬细胞的凋亡进程。

7结论

目前，关于鱼类Caspases的研究尚处于初始阶段，虽然有关Caspases基因家族的分子克隆与表达分析的研究已有较多报道，但关于鱼类细胞凋亡过程中Caspases各分子之间的相互作用、信号传导机制的研究报道较少。因此，通过借鉴哺乳动物Caspases基因功能的研究成果与技术方法，对鱼类Caspases通路分子的蛋白功能及其信号通路传导机制进行深入研究将成为今后研究的重点。

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Research Progress on Caspase Apoptosis Pathway in Fish

ZHANG Zai-peng, FENG Jian-jun*

(Fisheries College，Jimei University，Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea，Ministry of Agriculture, Xiamen, Fujian 361021)

AbstractWe introduced the research status of Caspase concept and classification and its application in mammals. Research progress of tissue expression of fish Caspases gene was reviewed, as well as its expression in embryonic development, expression under stress state, and protein function of fish Caspases molecular. The research direction of fish Caspases in future was forecasted.

Key wordsApoptosis; Caspase; Teleost

基金项目国家自然科学基金项目(31272685)；福建省海洋与渔业厅项目(201212140006)；福建省自然科学基金项目(2016J01164)；集美大学创新团队基金项目(2010A001)；集美大学科研基金项目(C60819)。

作者简介张在鹏(1987- )，男，山东潍坊人，硕士研究生，研究方向：水产动物免疫学。*通讯作者，副教授，从事水产动物免疫学研究。

收稿日期2016-03-31

中图分类号Q 255

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)11-004-02