反式和顺式白藜芦醇淬灭自由基能力研究

张珊珊，胡安胜，郭振滨，朱虹，李松（.空军勤务学院，江苏徐州000；.徐州儿童医院，江苏徐州000）



反式和顺式白藜芦醇淬灭自由基能力研究

张珊珊1，胡安胜1，郭振滨1，朱虹1，李松2
（1.空军勤务学院，江苏徐州221000；2.徐州儿童医院，江苏徐州221000）

摘要：用乙醇从何首乌（Polygonum multiflorum Thunb）中提取白藜芦醇单体，在254 nm紫外灯下照射18 min诱导成为顺式单体。用HPLC纯化分离出反式和顺式白藜芦醇，使用CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA体系检测两种单体的淬灭羟自由基的能力。结果显示，顺式单体较反式单体具有更显著地淬灭羟自由基的能力。

关键词：何首乌；白藜芦醇；自由基

白藜芦醇作为一种天然产物，近来的医学和营养学研究表明其对人体健康十分有益。白藜芦醇广泛分布于约70种高等植物中，如在一些传统中草药中以共轭或游离形式存在。白藜芦醇具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗菌、类雌样激素以及对心血管系统等与氧化应激损伤有关的疾病均有明显的作用[1]。近年来，有关白藜芦醇抗氧化作用一直是人们研究的热点，但大多采用生理指标作判定，生物发光检测技术对白藜芦醇特别是顺式异构体的抗DNA氧化损伤进行研究的国内报道很少。

本试验使用CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA化学发光体系产生·OH，·OH损伤DNA产生化学发光，检测了从何首乌中提取的正式与反式白藜芦醇对DNA损伤的抑制作用及其差别。

1试验材料与方法

1.1仪器

BPCL-4型微弱发光测量仪：中国科学院生物物理研究所设计并制造；Multispec-1501 Shimadzu二极管阵列检测器：岛津仪器公司；AKTA Purifier 900快速分子分离纯化系统：安玛西亚（中国）有限公司；2996型光电二极管阵列检测器、1525型二元HPLC泵：Waters公司；C18色谱柱（DiamonsilC18，4.6mm×250mm，5 μm）；WD-9403C型紫外分析仪（300 nm透射、254 nm反射、365 nm反射）：北京市六一仪器厂；SPB-1型无噪音无油空气压缩机、8PN-3600型全自动氮气发生器：北京色谱分析技术研究所；分析天平（MA200型电子天平）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵、RE-52A旋转蒸发器：巩义市英峪予华仪器厂；索氏提取器、捣碎机、微量注射器等。

1.2试剂

反式白藜芦醇标准品（纯度99 %）、VC（分析纯）、鲁米诺（分析纯）：Sigma公司；甲醇（色谱纯）：迪马公司；无水乙醇（分析纯）：北京化工厂；无水硫酸铜（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；邻啡罗啉（分析纯）：天津市赢达稀贵化学试剂厂；鱼精DNA（分析纯）：北京拜尔迪生物公司；30 %过氧化氢（分析纯）、乙酸钠、冰醋酸、硫酸亚铁胺：北京化学试剂厂。

1.3材料

中药何首乌：购自于徐州市同仁堂药店。

1.4方法

1.4.1白藜芦醇对照制备

精确称取一定量的反式白藜芦醇对照品，溶于甲醇，配成质量浓度为100 mg/L的对照品溶液。于-40℃冰箱避光保存。254 nm特定波长累计照射1 min，诱导白藜芦醇由反式结构向顺式结构转化。反式和顺式白藜芦醇紫外吸收光谱鉴定：在230 nm~300 nm范围，利用二极管阵列检测器（PDA）对诱导的Z-白藜芦醇进行定性分析[2]。

1.4.2何首乌中白藜芦醇的萃取

采用搅碎机将何首乌粉碎至80目（原料含水量小于10 %）[3]。过80目筛后取20 g何首乌粉和50 mL体积分数为95 %的乙醇一起置于捣碎机中，捣碎30 s，负压抽滤，收集滤液，滤渣用50 mL体积分数为95 %乙醇重复提取抽滤5次，合并滤液。冷冻干燥至原体积的1/4。

1.4.3高效液相色谱法纯化白藜芦醇

色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流动相中，A液为15 %乙腈和0.1 %的三乙胺水溶液，B液为100 %乙腈，梯度洗脱，20 min内由100 %A液变为100 %B液。流速为0.6 mL/min，紫外可见光检测器波长为308 nm检测，进样量20 mL。二极管阵列检测器（PDA）的波长范围为250 nm~400 nm。

1.4.4化学发光法检测竹叶提取物体外抗DNA损伤的能力

本试验采用Cu2+催化H2O2产生·OH，·OH又能导致DNA的氧化损伤，经邻菲啰啉增强发光，在化学发光仪上测定发光值。具体方法如下：用0.1 mol/L醋酸盐缓冲液（pH5.5）配制CuSO4-Phen-VC-DNA溶液，使Cu2+、Phen、VC、DNA终浓度分别为5×10-5mol/L、3.5× 10-4mol/L、3.5×10-4mol/L、1 μg/mL。取该溶液1 mL，放入发光仪样品池中，再加入0.1 mL不同浓度的黄酮（对照组用去离子水代替）。立即放入样品槽中测化学发光动力学曲线，于120 s时加入200 μL 3 %的H2O2溶液，在高压值定为1100V，系统噪声值小于100，48℃恒温下测量化学发光反应动力学曲线。每组试验重复3次。

在进行白藜芦醇定量分析时要严格避光，防止见光分解[4]。

2结果与分析

2.1反式和顺式白藜芦醇的纯化

利用1.4.3所设置的色谱条件，将何首乌中的反式白藜芦醇以及诱导后的顺式白藜芦醇进行分离（如图1）在色谱条件上可以清晰的看出经过诱导以后，出现了顺式白藜芦醇。与对照品吸收光谱一致。

图1紫外光诱导前后萃取液的RP-HPLC色谱图Fig.1 RP-HPLC profiles of extracts before and after UV-induced isomerisation

在上述色谱条件下，在检测器出口收集白藜芦醇组分。可多次收集，合并收集液，用氮气吹干溶剂，得到反式和顺式白藜芦醇浓缩物。

2.2反式和顺式白藜芦醇对CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA化学发光体系中·OH引起的DNA氧化损伤的保护作用

将顺式不同浓度的白藜芦醇加入发光体系中进行抗氧化的检测，进行实时监测，绘制成图表，见图2。

图2顺式白藜芦醇在CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA体系中化学发光Fig.2 Photon count of CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA reaction with Z-resveratrol as hydroxyl radical quencher

由图2可看出，与对照I和VI比较，IV和V对·OH造成的DNA氧化损伤有明显的抑制作用。因III的峰高明显比对照I低，但又比对照VI稍高，因此，抑制DNA损伤的下限浓度可暂定为III= 0.1 μg/mL左右。

将反式不同浓度的白藜芦醇加入发光体系中进行抗氧化的检测，进行实时监测，绘制成图表，见图3。

图3反式白藜芦醇在CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA体系中的化学发光图Fig.3 Photon count of CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA reaction with Z-resveratrol as hydroxyl radical quencher

为了避免体系自身衰减对低浓度样品（II和III）试验的影响，可通过与甲醇对照组比较出峰时间的变化和峰高的变化，来判断低浓白藜芦醇Z-单体是否有抑制·OH对DNA造成损伤的作用（图4、图5）。

图4反式和顺式白藜芦醇样品含量的变化对光子计数值的影响Fig.4 Influence of E-and Z-resveratrol amounts on the maximum photon count

由上图可看出，浓度较低时，反式和顺式得出峰时间大致相同，浓度较高的4号和5号样品在出峰时间上出现了明显的区别。可得出反式白藜芦醇延迟DNA氧化损伤效果较顺式异构体好。

图5反式和顺式白藜芦醇样品含量的变化对和出现时间的影响Fig.5 Change of E-and Z-resveratro content of sample and time of appearance

由上图看出，两样品的浓度顺序大致相同，反式单体对峰高的抑制效果比顺式单体稍好一些。

3　结论

由以上数据可得出结论：反式白藜芦醇对CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA体系中羟自由基氧化损伤DNA有显著抑制作用；并且这种抑制作用好于顺式异构体。

参考文献：

[1]赵文恩.类胡萝卜素抗氧化性质的研究[J].郑州大学学报,2003, 24(1):38-46

[2]张煜梅,黄健花,金青哲,等.反式及顺式白藜芦醇光稳定性分析[J].食品发酵工业,2013,39 (11):250-252

[3]王莹,李梦耀,马岚,等.虎杖中白藜芦醇的提取与纯化[J].应用化工,2014,43(1): 128-131

[4]王元成,伍春,陈虎,等.桑白皮中白藜芦醇、氧化白藜芦醇和桑皮苷的抗氧化活性[J].食品科学,2011,32(15):135-138

Study on Free Radical by E-and Z-isomers of Resveratrol

ZHANG Shan-shan1，HU An-sheng1，GUO Zhen-bin1，ZHU Hong1，LI Song2
（1. The air force institute of service，Xuzhou 221000，Jiangsu，China；2. Xuzhou Children's Hospital，Xuzhou 221000，Jiangsu，China）

Abstract：This experiment used the ethanol from polygonum multiflorum thunb extract resveratrol monomer，on the 254 nm under UV light irradiation induced by 18 min into CIS monomer. With HPLC isolation and purification of a trans and CIS resveratrol，the ability to use CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA system for detection of two kinds of monomer quenching hydroxyl free radical. The results showed，compared with the trans CIS monomer monomer has the ability to significantly quenching hydroxyl free radical.

Key words：polygonum multiflorum thunb；resveratrol；free radieal

收稿日期：2015-04-18

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.044

作者简介：张珊珊（1982—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：食品安全与检测。