金银花不同提取物抗氧化活性的研究

刘豪，张冬青，刘硕，马淑红，张艳玲，董阿力德尔图，朝格图（内蒙古大学化学化工学院，内蒙古呼和浩特010021）



金银花不同提取物抗氧化活性的研究

刘豪，张冬青，刘硕，马淑红，张艳玲*，董阿力德尔图，朝格图
（内蒙古大学化学化工学院，内蒙古呼和浩特010021）

摘要：初步研究金银花不同提取物的抗氧化活性。将金银花药材用石油醚脱脂后，分别用无水乙醇、95 %乙醇、90 %乙醇、80%乙醇、70%乙醇、60%乙醇和50%乙醇提取，采用紫外-可见分光光度法对不同溶剂提取物的绿原酸、总黄酮和总酚含量进行分析，并测试各提取物对羟基自由基（·OH）和二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）的清除作用以对其抗氧化活性进行比较。结果表明：金银花95%乙醇提取物绿原酸、总黄酮和总酚含量最高，分别为123.99、242.62和48.76 mg/g；95 %乙醇提取物清除·OH和DPPH·能力也最强，清除率分别为90.69 %和65.64 %。可见，金银花清除·OH和DPPH·自由基的能力与绿原酸、黄酮和多酚的含量具有一定的相关性。

关键词：金银花；抗氧化活性；绿原酸；总黄酮；总酚；羟基自由基（·OH）；二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）

金银花为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或带初开的花，药用历史悠久，具有清热解毒、疏散风热的功能。现代药理研究表明金银花具有抗病原微生物、抗炎、抗生育、解热、保肝、止血、降血脂、抗氧化、中枢兴奋和免疫调节等功效[1-4]。金银花含有挥发油、萜类、环烯醚萜苷类、三萜皂苷类、黄酮类、有机酸类、无机元素及其他等多种化学成分。2014年，国家卫生部《按照传统既是食品又是中药材物质目录管理办法》中明确了金银花既是食品又是药品，长期食用无毒副作用，它具有独特的清香，悦鼻清心，滋味醇和，鲜爽回甘，是我国民间人们历来非常喜爱而且重要的传统保健饮品[5]。目前普遍认为绿原酸等有机酸类和黄酮类是金银花的活性物质[6-12]。然而这些成分与抗氧化活性之间的相关性研究尚不深入。本文利用紫外-可见分光光度法对金银花不同提取物的绿原酸、总黄酮和总酚含量以及清除羟基自由基（·OH）和二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）活性进行了分析，拟对金银花活性成分与抗氧化活性的相关性进行探讨，为该药食同源品种的深入研究提供数据参考和试验支撑。

1材料与方法

1.1材料与试剂

金银花药材（产地河南）：购自亳州市京皖中药饮片厂，经鉴定为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或带初开的花；石油醚（b.p. 60℃~ 90℃）、乙醇、95 %乙醇、硫酸亚铁、磷酸二氢钠、磷酸二氢钠、双氧水：天津市北联精细化学品开发有限公司，均为分析纯；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、碳酸钠：国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯；DPPH（≥96 %）、焦性没食子酸（分析纯）、邻二氮菲：上海晶纯生化科技股份有限公司；芦丁标准品（HPLC≥98%）：北京世纪奥科生物技术有限公司。

1.2仪器与设备

U-3900H紫外可见分光光度计：日本日立公司；RE-52旋转蒸发仪：上海亚荣；SHB-Ⅲ循环水式真空泵：巩义予华；DZF-6090真空干燥箱：上海一恒；MILLI-Q DIRECT 8超纯水器：美国Millipore；VFD-1000冷冻干燥机：北京博医康；FA1004分析天平：上海精天；pH计：上海奥豪斯；DF-101XP集热式水浴锅：金坛市正基。

1.3方法

1.3.1金银花的提取

将干燥金银花粉碎，各称取25 g，经石油醚脱脂后，分别用无水乙醇、95 %乙醇、90 %乙醇、80 %乙醇、70 %乙醇、60 %乙醇和50 %乙醇超声辅助提取0.5 h，各3次，将各提取液过滤、减压浓缩并冷冻干燥后得到各提取物。

1.3.2绿原酸含量的测定

参考文献[13]，称取绿原酸标准品0.010 0 g，配成1 g/L的溶液。分别准确吸取绿原酸标准品0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mL于已编号的10 mL比色管内，用60 %乙醇稀释到刻度。各标准品浓度为5、10、15、20、25、30 mg/L，以60 %乙醇为参比，在波长为328.5 nm处测定吸光度。以A为纵坐标，c为横坐标绘制标准曲线。将待测样品用60 %乙醇配制成50 mg/L溶液后测定。以60 %乙醇为参比溶液，在328.5 nm处测定吸光度。 [14-16]，以芦丁作对照品，测定金银花不同提取物的总黄酮含量。准确吸取60 %乙醇配置浓度为0.6 mg/mL的芦丁标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于10 mL试管内，分别加入2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL的60 %乙醇溶液；再加入5 %亚硝酸钠溶液0.5 mL摇匀，放置6 min；加入10 %硝酸铝溶液0.5 mL，放置6 min；加入4 %氢氧化钠溶液4.0 mL，加60 %乙醇定容到10 mL，摇匀后，放置15min；扫描找到最大吸收波长为505 nm，在此波长处测定吸光度。用0.0 mL作为空白，用芦丁含量的浓度作为横坐标，纵坐标为一定浓度下所对应的吸光度，作标准曲线。金银花不同提取物分别配制成1 g/L溶液后同法测定，将其吸光度值代入上述标准曲线方程得到金银花不同提取物中黄酮的含量。试验重复3次。测定结果见表2。 [17-18]，以焦性没食子酸作对照品，采用Folin-ciocalteu法测定金银花不同提取物的总酚含量。精确吸取浓度为0.020 mg/mL的焦性没食子酸溶液0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL，分别置于10 mL比色管中，都加入5 mL去离子水、0.5 mL的Folinciocalteu试剂，1 min后加入1.5 mL浓度为75.0 mg/mL 的Na2CO3溶液，去离子水定容至刻度，摇匀，75℃水浴反应10 min。在最大吸收波长767 nm处测定吸光度。用0.00 mL作为空白，用焦性没食子酸含量的浓度作为横坐标，纵坐标作为一定浓度下所对应的吸光度，作标准曲线。金银花不同提取物按1.3.3配制后同法测定，将其吸光度值代入上述标准曲线方程得到金银花不同提取物中总酚的含量。试验重复3次。

1.3.3总黄酮含量的测定

1.3.4总酚含量的测定

1.3.5对·OH自由基清除作用的测定

将金银花不同溶剂提取物用60 %乙醇配成1 g/L的溶液，VC用去离子水配成0.1g/L的溶液。参考文献[19]的方法，精确移取0.75 mmol/L邻二氮菲溶液0.5 mL，pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）1 mL和双蒸水0.5 mL，摇匀，再加入0.75 mmol/L硫酸亚铁0.5 mL，摇匀，最后再加入0.01 %过氧化氢溶液0.5 mL，37℃恒温水浴60 min，在509.5 nm处测定其吸光度，记作A损；另一比色管中用0.5 mL双蒸水代替0.5 mL过氧化氢，测定其吸光度，记作A未；再在一比色管中用不同浓度梯度的VC对照溶液或金银花不同溶剂提取物样品溶液代替0.5 mL双蒸水，以双蒸水为空白。在509.5nm处测其吸光度，记作A样。平行测定3次，记录吸光度，计算不同浓度VC对照溶液或金银花不同溶剂提取物样品溶液对羟基自由基的清除率。

1.3.6对DPPH·自由基清除作用的测定

金银花不同提取物与VC按1.3.5配制。参考文献[19-20]的方法，DPPH用60 %乙醇配成65 μmol/L溶液，加样于具塞比色管中，摇匀反应30 min后，用紫外-可见分光光度计于520 nm（DPPH最大吸收波长）处测定吸光度（60 %乙醇溶液为参比）。1.5mL65μmol/L DPPH溶液加入1.5 mL 60 %乙醇溶液的吸光度记为A0，1.5mL65μmol/LDPPH溶液加入1.5mL样品溶液的吸光度记为Ai，1.5mL60%乙醇溶液加入1.5mL样品溶液的吸光度记为Aj。取3次试验的平均值计算清除率。

2结果与分析

2.1金银花不同提取物的提取率

金银花不同提取物的提取率见表1。

表1金银花不同溶剂提取物的提取率Table 1 Extract yield of the flower buds of Lonicera japonica by different solvents

由表1可知，金银花60 %乙醇提取物得率最高，为27.41 %。

2.2金银花不同提取物的绿原酸、总黄酮、总酚含量

采用吸光值外标法计算出金银花不同溶剂提取物中的绿原酸、总黄酮、总酚含量，结果见表2。

表2金银花不同提取物的绿原酸、总黄酮和总酚含量Table 2 Contents of total flavonoids，total phenols and lutein of different extracts of the flower buds of Lonicera japonica

绿原酸标准品溶液浓度与吸光值的回归方程为：y = 0.073 52x-0.004 5（R2= 0.999 6）。经分析比较可知，金银花各提取物中绿原酸含量的高低顺序为：95 %乙醇提取物>60 %乙醇提取物>50 %乙醇提取物>无水乙醇提取物>90 %乙醇提取物>80 %乙醇提取物>70 %乙醇提取物。

芦丁标准品溶液浓度与吸光值的回归方程为：y = 0.015 77x - 0.011 62（R2= 0.999 7）。经分析比较可知，金银花各提取物中总黄酮含量的高低顺序为：95 %乙醇提取物>60 %乙醇提取物>50 %乙醇提取物>90 %乙醇提取物>70 %乙醇提取物>80 %乙醇提取物>无水乙醇提取物。

焦性没食子酸标准品溶液浓度与吸光值的回归方程为：y = 0.151 4x - 0.086 78（R2= 0.990 7）。经分析比较可知，金银花各提取物中总酚含量的高低顺序为：95 %乙醇提取物>60 %乙醇提取物>50 %乙醇提取物>90 %乙醇提取物>70 %乙醇提取物>80 %乙醇提取物>无水乙醇提取物。

2.3金银花不同提取物对·OH的清除作用

金银花不同提取物和VC对·OH的清除作用见表3。

表3金银花不同提取物和VC对·OH的清除作用Table 3·OH scavenging effects of different extracts of the flower buds of Lonicera japonica and VC

利用邻二氮菲法，测得金银花不同提取物对羟基自由基的清除能力由大到小依次为：VC>95 %乙醇提取物>90 %乙醇提取物>60 %乙醇提取物>80 %乙醇提取物>无水乙醇提取物>70 %乙醇提取物>50 %乙醇提取物。其中，除VC外，95 %乙醇提取物的清除能力最强，清除率为90.69 %；而50 %乙醇提取物的清除能力最弱，清除率为30.53 %。

2.4金银花不同提取物对DPPH·的清除作用

金银花不同提取物和VC对DPPH·的清除作用见表4。

表4金银花不同提取物和VC对DPPH·的清除作用Table 4 DPPH·scavenging effects of different extracts of the flower buds of Lonicera japonica and VC

由表4可知，金银花不同溶剂提取物对DPPH·的清除能力依次为：VC>95 %乙醇提取物>无水乙醇提取物>90 %乙醇提取物>80 %乙醇提取物>60 %乙醇提取物>50 %乙醇提取物>70 %乙醇提取物。其中，除VC外，95 %和无水乙醇提取物清除DPPH·的能力是最强的，清除率分别为65.64 %和63.90 %；而70 %乙醇提取物的清除能力是最弱的，为38.55 %。

3　结论

上述研究发现，金银花各提取物中绿原酸、黄酮和多酚含量较高的前三位分别依次是95 %乙醇提取物、60 %乙醇提取物、50 %乙醇提取物，而且绿原酸、黄酮和多酚含量的大小顺序完全一致；其中，金银花95 %乙醇提取物的绿原酸、黄酮和多酚含量最高，其清除OH·和DPPH·自由基的能力也最强。可见，金银花95 %乙醇提取物具有最佳的抗氧化活性。金银花清除OH·和DPPH·自由基的能力与绿原酸、黄酮和多酚含量具有一定的相关性，但是并不呈线性的正相关性。金银花除含有绿原酸、黄酮和多酚，还含有挥发油、萜类、环烯醚萜苷类、三萜皂苷类、有机酸类、无机元素等多种化学成分，其抗氧化活性是其中所含有多种成分综合作用的结果。除绿原酸、黄酮和多酚外，金银花中可能还含有其他具有抗氧化活性的化学成分。因此，金银花95 %乙醇提取物具体都含有哪些抗氧化活性成分，其抗氧化能力有何不同，作用机理有何区别，各个成分之间有无协同作用，这些都有待进一步深入研究。

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Study on the Antioxidant Activity of Different Extracts of the Flower Buds of Lonicera japonica

LIU Hao，ZHANG Dong-qing，LIU Shuo，MA Shu-hong，ZHANG Yan-ling*，DONG Alideertu，Tsogt
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Inner Mongolia University，Hohhot 010021，Inner Mongolia，China）

Abstract：The antioxidant bioactivity of different extracts of the flower buds of Lonicera japonica was studied preliminarily in this paper. After extraction by petroleum ether，100 % ethanol，95 % ethanol，90 % ethanol，80 % ethanol，70 % ethanol，60 % ethanol and 50 % ethanol was used to extract the flower buds of Lonicera japonica. The ultraviolet-visible spectrophotometry was applied to test the contents of chlorogeinc acid，total flavonoids and total polyphenols. To compare the antioxidant bioactivity of different extracts of the flower buds of Lonicera japonica，·OH and DPPH·free radical scavenging ability were measured as well. The results showed that 95 % ethanol extract had highest content of chlorogeinc acid，total flavonoids and total polyphenols，that was 123.99 mg/g，242.62 mg/g and 48.76 mg/g；95 % ethanol extract had the strongest·OH and DPPH·radical scavenging ability with scavenging ratio of 90.69 % and 65.64 %. Thus，·OH and DPPH·scavenging capacity presented probably positive relatively with concentration of chlorogeinc acid，total flavonoids and total polyphenols.

Key words：the flower buds of Lonicera japonica；antioxidant bioactivity；chlorogenic acid；total flavonoids；total polyphenols；hydroxyl radical（·OH）；diphenyl picryl hydrazinyl radical（DPPH·）

收稿日期：2015-09-07

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.013

*通信作者

作者简介：刘豪（1995—），男（汉），本科生，研究方向：分析化学。

基金项目：国家自然科学基金地区项目（31160332）；内蒙古自治区高等学校科学技术研究项目（NJZZ13015）；内蒙古大学高层次人才引进科研启动项目（Z20100108）