蜂胶中芦丁和槲皮素的含量及抗氧化性能研究

王春玲（齐鲁师范学院生命科学学院，山东济南250013）



蜂胶中芦丁和槲皮素的含量及抗氧化性能研究

王春玲
（齐鲁师范学院生命科学学院，山东济南250013）

摘要：用高效液相色谱对蜂胶乙醇提取物（EEP）中的芦丁和槲皮素含量进行测定，并对不同处理方法得到的EEP进行抗氧化性能研究。结果表明，芦丁和槲皮素在不同试验样品的含量分别为：粗蜂胶中的含量分别是1.823 %和6.03 %，超声波辅助乙醇提取物中的含量分别为3.134%和6.138%，经大孔树脂纯化后其含量分别为4.256 %和13.483 %。通过Schaal烘箱法表明蜂胶中黄酮类化合物含量越高，抗氧化效果越好。

关键词：芦丁；槲皮素；高效液相色谱；抗氧化性能

蜂胶是蜜蜂用来防护、抵御病虫害和病原微生物入侵巢房的御敌物质，同时也是作为修补巢房和内环境消毒杀菌的一种特殊物质[1-2]。蜂胶的化学组成特征是含有多种类黄酮化合物，蜂胶因此被称为“黄酮类化合物的宝库”[3]，蜂胶的大部分生理及药理功能都与此类物质有密切关系[4]。

从20世纪60年代以来，人们对黄酮或酚类化合物的抗氧化性质，特别是其在食用油脂中的抗氧化活性做了大量研究[5－9]。Ozcan等[10]用蜂胶的甲醇提取物（浓度从0.02 %~0.08 %）加入到橄榄油中，在60℃贮存，结果表明蜂胶甲醇提取物的浓度在0.06 %和0.08 %时的抗氧化作用要好于0.01 %的BHA和BHT。

从20世纪50年代末，随着各种色谱分离技术的迅速发展与质谱新技术的出现，使蜂胶的化学成分研究迅速发展，目前世界各地蜂胶样品中分离出来的黄酮类化合物已有70多种。蜂胶中的黄酮类化合物主要包括黄酮醇类、黄酮类和黄烷酮类。常见的黄酮醇类有高良姜素、槲皮素、芦丁、杨梅酮、山奈酚，黄酮类有芹菜素、白杨黄素，黄烷酮类有生松素等[11-13]。随着气质联用、核磁共振等现代分析新技术的发展，近年来国内外科学家又鉴定出上百种蜂胶新成分[14-16]。

作者前期已对蜂胶中黄酮类化合物的提取、纯化及抗氧化性能进行过相关研究，在此进一步用高效液相色谱对不同处理方法得到的蜂胶产品中的芦丁和槲皮素进行分离鉴定，并验证蜂胶中黄酮类化合物含量与抗氧化性能的相关性，以期为开发蜂胶产品作为天然食品添加剂提供一定的理论参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要材料

蜂胶：购自河南福美蜂产品有限公司；芦丁标准品、槲皮素标准品：中国药品生物制品检定所；猪油（新鲜猪板油）：实验室熬制，过滤后置冰箱内备用。

1.1.2主要试剂

乙醇，氢氧化钠，硝酸铝，亚硝酸钠，异辛烷、冰醋酸，碘化钾，硫代硫酸钠，重铬酸钾，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，磷酸，可溶性淀粉等（均为AR级）。甲醇（色谱纯），重蒸水。

维生素E、茶多酚、特丁基对苯二酚（TBHQ）：均为食用级。

1.2主要仪器

KQ-250超声波清洗器、RE-52C旋转蒸发器、SHZ-D循环水式真空泵：河南巩义英峪予华仪器厂；722S分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；101－1干燥箱：上海市实验仪器总厂；THZ-82B气浴恒温振荡器：江苏省金坛市医疗仪器厂；LC10A高效液相色谱仪、紫外检测器SPD-10AV、色谱柱：Kromasil－C18柱（0.4×25 cm）：日本岛津仪器有限公司。

1.3试验方法

1.3.1蜂胶原料处理

将冷冻的粗蜂胶粉碎后过20目筛后存入冰箱中备用，即为粗蜂胶样品。

1.3.2蜂胶处理方法

将蜂胶原料按超声波辅助法最佳提取工艺提取得蜂胶超声波辅助法提取物试验样品，再按大孔树脂最佳纯化工艺处理得本次大孔树脂纯化后试验样品[17-18]。

1.3.3色谱条件

流动相为65 %甲醇－35 %水（用磷酸调pH至3）；流速为0.7 mL/min；柱温40℃；检测波长为270 nm；进样量10 μL。

1.3.4标准溶液的制备

蜂胶黄酮类化合物标准溶液：精密称取芦丁、槲皮素标样各7.0 mg于50 mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀备用。

样品液的制备：称取蜂胶样品0.100 g（精确到0.001 g），放入50 mL的容量瓶中，加入40 mL甲醇，在超声波水浴中振荡，待样品溶解后，用甲醇定容，用0.5 μm的滤膜过滤，滤液备用。

1.3.5蜂胶黄酮类化合物的抗氧化性能试验

1.3.5.1采用Schaal烘箱法

以自制猪油为底物，采用Schaal烘箱法进行测定[19]。

1.3.5.2过氧化值的测定

参照GB/T5538-2005《动植物油脂过氧化值的测定》。

2结果与分析

2.1 HPLC检测图谱

采用高效液相色谱法对芦丁和槲皮素标准品以及各不同处理方法得到的蜂胶样品扫描得到的图谱如图1～4所示。

图1芦丁和槲皮素标样的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of standard sample of rutin and quercetin

图2粗蜂胶样品的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of curde propolis

图3蜂胶超声波法提取物的高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of ultrasonic ethanol extract of propolis

图4大孔树脂纯化后的蜂胶产品的高效液相色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of purified propolis by macroreticular resin

由图1可以看出，所用的HPLC法可将含有芦丁和槲皮素标样的混合物在15 min内完全分离。芦丁和槲皮素标样在本试验色谱条件下，色谱基线平直，都呈现单一色谱峰，且峰形对称，无拖尾现象，杂质也无干扰。芦丁出峰较早，其保留时间为5.387 min，槲皮素的保留时间为9.673 min。

在党中央迁往当时北平的路上，毛泽东意味深长地说：这是“进京赶考”。“我们决不当李自成，我们都希望考个好成绩！”这考官自然是以工农为主体的人民大众。

由图2～4可以看出，HPLC可以快速分离蜂胶中的黄酮类化合物。在本试验色谱条件下，所有的峰基本都被很好的分开。其中粗蜂胶中分离出26种组分；超声法蜂胶提取物中分离出27种组分；经大孔树脂纯化后的蜂胶样品中分离出23种组分。由于标样的的原因，只能从中鉴定出芦丁和槲皮素。从响应值上可以看出，蜂胶的超声提取物中的黄酮含量要高于粗蜂胶中的黄酮含量，低于纯化后的蜂胶样品的黄酮含量。就芦丁和槲皮素来说，粗蜂胶中的含量分别是1.823 %和6.03 %，经超声波提取后，含量分别为3.134 %和6.138 %，经大孔树脂纯化后其含量分别为4.256 %和13.483 %。

2.2稳定性试验

精密吸取槲皮素和芦丁标准品溶液，进样量均为10 μL，注入HPLC色谱仪进行分析，每隔4 h测定一次，总共测16 h，记录色谱。测定结果见表1。

表1稳定性试验结果Table 1 The results of stability test

槲皮素平均峰面积值为195.48，RSD为0.86 %；芦丁的平均峰面积值为167.45，RSD为0.92 %。试验结果表明，本品溶液在16 h内基本稳定，其峰面积基本不变。

2.3精密度试验

取混合标准溶液，按上述色谱条件，每次进样10 μL，连续进样5次，以峰面积定量，分别计算芦丁和槲皮素的R S D在1.25 %～2.79 %，表明该试验条件下测定各蜂胶样品中的芦丁和槲皮素的含量，仪器精密度良好。

2.4抗氧化试验

前期试验已研究过蜂胶提取物的抗氧化性能，在此有对纯化前后的蜂胶样品以猪油为底物进行了抗氧化试验。如图5，6所示。

由图5可以看出4种抗氧化剂对猪油的抗氧化性能的大小依次为：TBHQ＞蜂胶＞茶多酚＞维生素E。两种提取方法得到的蜂胶提取物抗氧化性能相当。

由图6可以看出，经大孔树脂纯化后的蜂胶的抗氧化性能要好于蜂胶粗提物，蜂胶的粗提取物在第11 d时过氧化值已达到22 meg/kg，而经纯化后的蜂胶提取物在第16天时才达到21 meg/kg，说明蜂胶的纯度越高，抗氧化效果越好。这是因为蜂胶经过大孔树脂吸附后，杂质含量减少，蜂胶中的有效成分即黄酮类化合物的含量提高了，单位质量中的总黄酮类化合物含量增加，因此抗氧化效果好。

图5不同抗氧化剂对猪油氧化稳定性的影响Fig.5 Effects on oxidation stability by different antioxidant of lard

图6纯化前后的蜂胶提取物对猪油氧化稳定性的影响Fig.6 Effects on oxidation stability by Before and after purified of propolis

3　结论

1）HPLC法可以快速分离鉴定蜂胶中的黄酮类化合物，在本试验色谱条件下，芦丁和槲皮素在不同处理方法下的含量分别为：粗蜂胶中的含量分别是1.823 %和6.03 %，经超声波辅助提取后，含量分别为3.134 %和6.138 %，经大孔树脂纯化后其含量分别为4.256 %和13.483 %，大孔树脂纯化效果明显。由于标样的关系，只能鉴定出蜂胶样品中的两种组分。

2）蜂胶乙醇提取物有良好的抗氧化效果，试验测得4种抗氧化剂对猪油的抗氧化性能的大小依次为：TBHQ＞蜂胶乙醇提取物＞茶多酚＞VE；纯化后的蜂胶提取物的抗氧化效果好于蜂胶粗提物，说明蜂胶中黄酮

类化合物含量越高，抗氧化效果越好。

3）我国蜂胶资源丰富，蜂胶中黄酮类化合物含量很高，而黄酮类化合物是食品中主要的天然抗氧化剂和添加剂。本试验也证实了蜂胶具有优良的抗氧化性能，虽然将蜂胶作为天然抗氧化剂在食品工业中广泛使用还有许多工作要做，比如固定的提取方法，急性和慢性毒理学试验等，但是随着研究的深入，未来蜂胶一定会成为很有前途的天然抗氧化剂。

参考文献：

[1] BURDOCK G A. Review of the Biological Properties and Toxicity of Bee Propolis(Propolis)[J].Food and Chemical Toxicology,1998,36(4): 347-363

[2] Ghisalberti E L. Propolis: a review[J]. Bee World,1979,60(2):59-84

[3]房柱.蜂胶—黄酮类化合物的宝库[J].蜜蜂杂志,1998(9):11－12

[4] Jsoep Serra Bonvehi, Francesc Ventura Coll, Rossend Escola Jorda. The Composition, Acitive Components and Bacteriostatic Activity of Propolis in Dietetics[J].JAOCS,1994,71(5):529-532

[5] Dziedzic S Z,Hudson B J F. Phenolic acids and related compounds as antioxidants for edible oils[J]. Food Chem,1984,14(1):45-51

[6] Dziedzic S Z, Robinson J L, Hudson B J F. Fate of propyl gallate and diphosphatidylethanolamine in lard during autoxidation at 120℃[J]. J Agric Food Chem,1986,34:1027-1029

[7] Dziedzic S Z,Hudson B J F. Polyhydroxy chalcones and flavanones as antioxidants for edible oils[J]. Food Chem,1983,12(3):205-212

[8] Stanley Z Dziedzic, Bertram J F Hudson.Hydroxy Isoflavones as Antioxidants for Edible Oils[J]. Food Chem,1983(11):161-166

[9] Bertram J F Hudson, Joseph I Lewis. Polyhydroxy Flavonoid Antioxidants for Edible Oils-Structural Criteria for Activity[J]. Food Chem, 1983(10):47-55

[10] Ozcan Musa.Use of propolis extract as a natural antioxidant for plant oils[J]. Grasas Aceites(Sevilla),2000,51(4):251-253

[11]叶陆星,胡福良.蜂胶中黄酮类化合物的生物学活性[J].养蜂科技,2002(2):9-11

[12]高荫榆,游海,陈岑,等.蜂胶黄酮类化合物超临界萃取工艺研究[J].食品科学,2002,23(8):154-157

[13] Alcncar SM, Oldoni TLC, Castro ML, et al. Chemical composition a biological activity of a new type of Brazilian pmpolis:Red propis[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2007(113):278-283

[14]黄帅,张翠平,胡福良.2008～2012年蜂胶化学成分研究进展[J].天然产物研究与开发,2013,25(8):1146-1153

[15]布威海丽且姆·阿巴拜科日,木塔力甫·艾买提,阿米尼姑丽·买买提,等.新疆蜂胶提取物抗氧化活性及槲皮素和白杨素含量测定[J].生物技术通报,2013(2):163-171

[16]周萍,邵巧云,徐权华,等.高效液相色谱法测定蜂胶中咖啡酸及8种黄酮类化合物的含量[J].蜜蜂杂志,2013(4):4-6

[17]王春玲,张玉军,刘建平,等.超声波对蜂胶中有效成分的提取率影响的研究[J].郑州工程学院学报,2003,24(4):28-33

[18]王春玲.大孔树脂纯化蜂胶乙醇提取物中总黄酮的研究[J].食品研究与开发,2013,34(11):21-24

[19]王春玲,张玉军,郑月贤,等.蜂胶中有效成分的提取及其抗氧化性能的研究[J].食品科学,2004,25(5):94-98

Study on the Content and Antioxidant Properties of Rutin and Quercetin in Propolis

WANG Chun-ling
（School of Life Sciences，Qilu Normal University，Jinan 250013，Shandong，China）

Abstract：The content of rutin and quercetin of ethanol extract of propolis was determined by HPLC，and the antioxidant activity of ethanol extract of EEP was also researched. Analysis showed：the content of rutin and quercetin was 1.823 % and 6.03 % respectively in crude propolis；3.134 % and 6.138 % respectively in ultrasonic assisted ethanol extract of propolis；4.256 % and 13.483 % respectively in purification by macroreticular resin.It showed that the more flavonoids contents of the propolis，the better antioxidant activity by Schaal oven method.

Key words：rutin；quercetin；HPLC；antioxidant activity

收稿日期：2014-05-15

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.010

作者简介：王春玲（1977—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白工程。