植物油DNA提取和基因检测研究进展

齐玲倩，刘秀，丁梦璇，刘远远，柯润辉，尹建军（中国食品发酵工业研究院，北京100015）



植物油DNA提取和基因检测研究进展

齐玲倩，刘秀*，丁梦璇，刘远远，柯润辉，尹建军
（中国食品发酵工业研究院，北京100015）

摘要：基因检测方法以其快速、高效、灵敏、准确的特点而广泛应用在植物油真实性和转基因成分鉴定中。但植物油大都经过精制加工，DNA含量极少且完整度低，这对植物油的基因提取和检测造成了极大的困扰。本文对植物油DNA提取和基因检测进展进行了综述，并对以后的发展进行了展望，以期为研究者提供一定的理论参考。

关键词：植物油；DNA提取；基因检测

植物油是人类日常生活的重要组成部分，但是近年来植物油市场出现了较多的掺假植物油和转基因植物油，例如掺杂大豆油、棕榈油的花生油，掺杂榛子油、杏仁油、玉米油的橄榄油和转基因大豆油，转基因菜籽油等[1-2]，这严重损害了消费者的利益，侵犯了消费者的知情权和选择权。

为了保障消费者的利益和权利，迫切需要对植物油的真实性和转基因成分进行鉴定。目前，植物油真实性的鉴定方法主要有色谱分析法、光谱分析法[3]和分子生物学方法，但是色谱分析法和光谱分析法都是基于理化成分的分析，容易受到季节、产地、生产条件等因素的影响，同时检测限度较高（≥5 %），而分子生物学方法则更能反映原料的真实性，且快速、灵敏、准确，因此在植物油真实性鉴定中应用广泛[4]。而植物油转基因成分的检测方法也主要是分子生物学方法。分子生物学方法有基于蛋白质和基于DNA的方法，但因为DNA有较高的热耐受性和酸碱耐受性，且在细胞内普遍存在，所以目前所使用的主要为基于DNA的分析方法。

但是，经过复杂的加工处理后，植物油的DNA降解为大小不一的碎片，且含量极低，这给植物油的基因提取和检测造成了极大的困难[5-7]。近年来很多研究者对此进行研究，并取得了一定的进展，本文对这些进展进行了详细的综述，以期为研究者提供一定的理论参考。

1植物油DNA的提取

国内外关于植物油DNA提取的报道，大多数采用试剂盒法提取[8-12]，但是因为精炼植物油中DNA含量少且完整度低，所以目前采用的试剂盒法均经过改良，而改良一般针对油样的前处理，目前研究较多的改良方法为乳化法、浓缩法及离心法。白立群等[13]先用等体积的无菌水对20 mL大豆油进行振荡乳化，接着利用冷冻干燥的方法进行浓缩，结果成功检测到大豆的Lectin基因。程红梅等[8]利用实验室自制试剂盒提取大豆油的DNA时，首先用10 mL的正己烷对油样进行乳化，结果从10 mL大豆油中提取出0.4 μg高纯度的DNA。Pasqualone[14]、Montemurro[15]、Alba[16]等在试剂盒提取之前都对橄榄油样品进行了离心分离，效果良好。

根据何景[4]和Joana Costa[17]的报道，在国外，应用在植物油DNA提取中的试剂盒主要有the Qiagen QIAamp DNA stool extraction kit、the Nucleospin food kit、the Wizard Magnetic DNA Purification System（Promega）for food，其中，the Wizard Magnetic DNA Purification System（Promega）Kit是应用的较为广泛的一种方法，主要原理是磁珠法，利用磁珠的磁性吸附核酸分子，而与油中的蛋白、脂肪、色素等杂质分离开。但是对于完全精制的植物油，Costa等[18]比较了the Nucleospinfood kit和the Wizard Magnetic DNA Purification System （Promega）for food的DNA提取效果，发现the Nucleospin food kit能从所有精制油样中提取出可扩增的DNA，而the Wizard Magnetic DNA Purification System （Promega）for food则不能，这与Zhang等[19]报道的利用the Wizard Magnetic DNA Purification System（Promega）for food不能提取出精炼大豆油的DNA相符。而在国内，应用在植物油DNA提取中的试剂盒主要为Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega）。覃文等[9]利用改良的Wizard Genomic DNA Purification Kit （Promega）从市售的玉米胚芽油，大豆色拉油中及混合油脂中提取出DNA，并扩增出相应的內源基因。何伟丽等[10]也利用改良的Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega）从大豆色拉油中提取出了可扩增出Lectin基因（118bp）的DNA。

虽然现有的研究大多集中于各种试剂盒法提取植物油中的DNA，但是，试剂盒法造价较贵，因此出现了一些提取的新方法。白立群等[13]建立了一种有效的精炼大豆油DNA提取新方法-冷冻干燥法，他们将该方法的DNA提取效果与改良的the Wizard Magnetic DNA Purification System（Promega）for food的DNA提取效果进行比较，发现冷冻干燥法的DNA富集效果以及检测的灵敏度都高于试剂盒法。姚菲等[20]建立了一种有效的菜籽油DNA提取新方法-改进的DNA法，他们将该改进的DNA提取方法与冷冻干燥法、高盐低pH法、改良SDS法、试剂盒法的DNA提取效果进行比较，结果发现该改进方法提取的DNA（OD260/OD280）纯度为1.7~2.0，浓度达到10 ng/μL，且适合实时荧光定量PCR检测，效果最好。

关于植物油DNA的提取，各种方法层出不穷，但是没有一个公认的、高效通用的提取方法。因此，发展高效通用的植物油DNA提取方法需要进行更深层次的研究。

2植物油DNA的检测

基因检测技术在植物油方面的应用主要集中在2个研究方向：转基因成分鉴定和真实性鉴定，植物油的真实性鉴定又包括掺假成分鉴定和原料品种鉴定2个方面[4]。

2.1植物油转基因成分和掺假成分鉴定

植物油转基因成分和掺假成分鉴定中常用的基因检测技术有定性PCR法、PCR-Gene Scan法、实时荧光定量PCR法、多重巢式PCR法及环介导等温扩增（LAMP）法[4-5]。

2.1.1定性PCR法

定性PCR法以其灵敏度高、简便快捷的特点而广泛应用于植物油的转基因和掺假成分鉴定上[5]。程红梅等[8]针对市场上出售的10种精炼大豆油DNA进行35S、Nos、Epsps、Lectin基因的PCR检测，其中，Lectin基因在10种大豆油中的扩增结果均呈阳性，其余3种基因在10种大豆油中也有阳性结果出现，这说明定性PCR法可以检测到植物油的外源基因。金红等[21]针对两个大豆色拉油品种的DNA进行35S、Nos、Epsps、Lectin基因的PCR扩增，结果这4种基因都出现了相应的扩增条带，且与转基因大豆一致。王德莲等[2]利用定性PCR法对掺有大豆油和棕榈油的花生油进行检测，结果当掺入的大豆油和花生油体积百分比达到10%时，该方法可以检测到大豆油和棕榈油的內源基因。

虽然定性PCR法灵敏简便，但是其分辨率低、容易污染、较难实现自动化，而且凝胶电泳时使用有毒试剂（EB、GoldWell等），同时也无法进行定量，这些方面限制了其在植物油转基因成分和掺假成分鉴定中的应用。

2.1.2 PCR-GeneScan法

PCR-GeneScan法是在特异性扩增反应后，用测序仪器对产物进行GeneScan扫描，可以区分相差一个碱基的DNA片段，省去了凝胶电泳检测，方便、快捷。覃文等[9]针对市售的大豆油、玉米油及混合油进行转基因成分检测，应用PCR-GeneScan法，以大豆、玉米的內源基因（Lectin、IVR）为质控，检测出了外源的CryIA（b）和Epsps基因。

相比于定性PCR法，该方法灵敏度较高，但是对操作人员及仪器设备的要求较高，普遍适用性不强。

2.1.3实时荧光定量PCR法

实时荧光定量PCR法（简称qPCR），是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累来对整个PCR进程进行实时监控，通过与标准曲线的对比来达到对未知模板定量的要求。白立群等[13]对5种品牌大豆油的DNA进行Lectin、CaMV35S和Nos基因的qPCR扩增，结果均为阳性，与商标标识一致。蔡翠霞等[22]对11种植物油的DNA进行CaMV35S的qPCR扩增，结果7种植物油的扩增结果呈阳性，与样品的成分标识一致。王德莲等[2]利用qPCR法对掺有大豆油和棕榈油的花生油进行检测，结果当掺入的大豆油和花生油体积百分比达到10 %时，该方法可以检测到大豆油和棕油的內源基因。

qPCR法灵敏度高、特异性强、再现性好，与定性PCR相比，交叉污染几率小、快捷、准确，其最低检测线可以达到pg级。但是，精准定量不理想，对仪器设备要求较高，检测费用较高。

2.1.4多重巢式PCR法

多重巢式PCR法结合了巢式PCR的高灵敏度和多重PCR的快速、简便和高特异性的特点，在植物油转基因成分检测中有一定的应用。王澎等[23]对转基因大豆油进行检测，单独用二重巢式PCR的3对引物进行扩增时并无明显片段，经巢式PCR扩增后则获得目的片段，证明二重巢式PCR可将含量较低的片段纯化，提高反应的特异性和灵敏性。敖金霞等[24]建立了五重巢式PCR对转基因大豆、玉米、水稻进行PCR检测，检测灵敏度达到0.000 5 %。

多重巢式PCR具有高通量、高特异性、高灵敏性的特点，但是其扩增2次，很容易出现交叉污染而导致假阴性结果[4]。

2.1.5环介导等温扩增（LAMP）法

环介导等温扩增（LAMP）法是一种恒温核酸扩增的新方法，该方法在恒温条件下，利LAMP法比普通PCR法高2个~5个数量级[4]，对仪器要求较低，检测成本少，操作及结果判定简单，但是该方法引物设计比较复杂，处理扩增产物时容易造成DNA污染，同时，蔡翠霞等[22]研究发现，对于食用植物油，LAMP检测存在产生假阴性结果的可能。

2.2植物油原料品种的鉴定

分子标记法具有共显性、多态性高、数量多等优点，被广泛用在植物油原料品种的鉴定上。对于植物油原料品种的鉴定，目前研究最多的植物油为橄榄油。据报道，应用在橄榄油原料品种鉴定上的分子标记主要有：随机扩增多态性DNA（RAPD），扩增片段长度多态性（AFLP），简单重复序列（SSR）和单核苷酸多态性（SNP）[17]。但是考虑到精制植物油中DNA完整度极低，需要对这些方法进行选择，以确定高效的应用于精制植物油原料品种鉴定的分子标记。

2.2.1 RAPD

RAPD操作简单，花费少，需要的植物基质的量比较少，被广泛应用在植物研究中，近年来也有研究报道了其在橄榄油真实性鉴定中的应用。然而，Muzzalupo，Perri[26]利用RAPD对橄榄叶和橄榄油沉淀中的DNA进行分子标记，结果发现叶中和油沉淀中的RAPD的结果并不一致。同样，Martins-Lopes等[27]用RAPD引物对9个品系的橄榄油DNA进行扩增，结果显示7个品系的橄榄油DNA具有多态性，多态性水平为78 %。对此，Joana Costa等[17]认为可能是由于橄榄油中DNA的完整度比较低，不能扩增出足够的指纹标记来对其真实性进行鉴定。由此看来，RAPD分子标记对于精炼植物油中DNA完整度低的问题，并不能够有效克服。

2.2.2 AFLP

AFLP是一种有效的多位点分子标记，无需基因组的序列信息，具有较高的多态性和可靠性，被广泛应用在大量作物和野生物种的基因型分析。Busconi等[28]用AFLP对单品种橄榄油中的DNA进行分析，结果显示油中的DNA与从相同品系叶子中提取的DNA有高度的一致性。但是，AFLP技术操作极其复杂，而且很难分析获得的大量条带，不适合混合品种的橄榄油鉴定。同时，Pafundo等[29]强调了DNA的低完整性，会对AFLP的再现性产生较大的影响。这使得该技术在精炼植物油真实性鉴定中的应用受到一定的限制。

2.2.3 SSR

SSR属于第三代分子标记，多态性高，广泛分布在植物基因组，辨别力强，是最可靠的分子标记之一，应用也最广泛。Rayda Ben-Ayed等[30]研究得出：利用SSR分子标记建立的检测方法可以对22种橄榄油品系进行鉴定。Alba等[16]对橄榄叶的SSR指纹与相应油的进行比较时，发现SSR片段有85.7 %的成功率，90 %的试验结果显示了叶和油SSR标记的良好一致性。但是，SSR标记所应用的扩增片段一般都比较短（小于300 bp），而较长的片段则不总是被扩增，使得其在较长片段上的应用受到了限制。

2.2.4 SNP

SNP是近年来发展起来的第三代分子标记，与其他分子标记相比，遗传稳定性高，位点丰富且分布广泛，能区分个体间的微小不同，可有效应用在橄榄油真实性鉴定上[31]。Consolandi等[32]利用SNP分子标记，设计了结合多重PCR与LDR-UA（连接酶测试反应-通用芯片）的技术，利用该技术，他们可以区分49个橄榄品种。因此，SNP分子标记有结合高通量技术的可能性，在进行多样品快速鉴定时，具有很大的优势。但是，SNP分子标记的发展需要结合基因组序列信息的发展，而目前可用的序列信息量较少[33]。

3总结和展望

综上所述，植物油DNA的质量影响基因检测的效率问题，是国内外研究的热点。对于DNA的提取，应用较多的为改良试剂盒法，但改良试剂盒法造价贵，且通用性差，一些DNA提取新方法花费的成本虽少，但也存在通用性差的特点，而行标法虽属于通用的植物油DNA提取方法，但是其有效性不理想，因此，需要对其进行更进一步的研究。对于DNA的检测，在转基因成分和掺假成分的鉴定方面，定性PCR法、PCRGeneScan法、qPCR法的检测结果容易受到精炼植物油DNA低含量和低完整度的影响，而出现假阴性，多重巢式PCR法和LAMP法灵敏度高，但多重巢式PCR容易出现交叉污染，LAMP法引物设计复杂，扩增产物处理时易污染，因此，灵敏度高、特异性好、操作简单快捷、精准定量、成本低的检测技术还有待进一步研究。在植物油原料品种的鉴定上，分子标记法具有共显性、多态性高、数量多等优点，被广泛用在在植物油真实性鉴定上，其中RFLP和AFLP的再现性容易受到DNA低完整性的影响，SSR标记的辨别力强，但是再现性容易受到大片段基因不总是被扩增的影响，SNP标记能区别个体间的微小不同，而且能够结合高通量技术，可以适应快速检测的需要，是最实用的植物油DNA检测的分子标记。但是，目前，结合高通量技术的SNP分子标记技术以及多种检测方法结合或并用的技术还不成熟，需要进行更深层次的研究。

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Advances in DNA Extraction and Gene Detection for Vegetable Oils

QI Ling-qian，LIU Xiu*，DING Meng-xuan，LIU Yuan-yuan，KE Run-hui，YIN Jian-jun
（China National Research Institute Food & Fermentation Industries，Beijing 100015，China）

Abstract：Methods for gene detection have been widely used in the authentication and GMO detection for vegetable oils because of their rapidity，efficiency，sensitivity and accuracy. While，as for vegetable oils，the low quantity and integrity of DNA caused by being refined increase the difficulties of DNA extraction and gene detection. In this paper，we review the progress of DNA extraction and gene detection for vegetable oils and make some respect for their future，so as to provide theoretical reference for the researchers in some degree.

Key words：vegetable oils；DNA extraction；gene detection

收稿日期：2014-12-09

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.053

*通信作者：刘秀（1979—），男（汉），高级工程师，研究方向：食品真实性检测。

作者简介：齐玲倩（1989—），女（汉），在读硕士研究生，研究方向：食品真实性的分子鉴别方法。