拟南芥主动去甲基化研究进展

梁文洁，李金超，舒 佳，舒志明，张跃进，梁宗锁，郭宏波，3*

(1.逆境生物学国家重点实验室，西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌 712100；2.北京大学生命科学学院，北京100080；3.大不列颠哥伦比亚大学生物系，加拿大基隆拿，v1v 1v7)



拟南芥主动去甲基化研究进展

梁文洁1，李金超2，舒 佳1，舒志明1，张跃进1，梁宗锁1，郭宏波1，3*

(1.逆境生物学国家重点实验室，西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌 712100；2.北京大学生命科学学院，北京100080；3.大不列颠哥伦比亚大学生物系，加拿大基隆拿，v1v 1v7)

摘要介绍了模式植物拟南芥主动去甲基化的最新进展，包括酶学过程、调控机制、去甲基化与甲基化平衡机制、研究方法及其生物学意义。这些进展对其他植物而言，除对调控机制可进行补充研究外，还对作物的重要经济性状，如育性调控、种子形成和抗逆基因筛选等的深入研究具有重要参考价值。

关键词拟南芥；DNA甲基化；去甲基化；作物性状

Advances on Active Demethylation of Arabidopsis

LIANG Wen-jie1, LI Jin-chao2, SHU Jia1, GUO Hong-bo1,3*et al(1. State Key Laboratory of Stress Biology in Arid Areas, College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100; 2. College of Life Sciences, Peking University, Beijing 100080; 3. Department of Biology, The University of British Columbia, Canada, Kolowna v1v 1v7)

AbstractThe advances of active demethylation onArabidopsiswere introduced, including enzymatic process, modulation mechanism, balance between demethylation and methylation mechanism, research methods and biological significance. For other plants, these advances could be used as references to carry out supplement researches on mechanism. This research is of great reference significance to the in-depth research on important economic characteristics of crops, such as fertility regulation, seed formation, and screening of stress genes.

Key wordsArabidopsis; DNA methylation; Demethylation; Economic characteristics

植物的遗传信息被编码在基因组4种核苷酸排列顺序中，其中胞嘧啶可以发生甲基共价修饰，形成甲基胞嘧啶(5-mC)[1-3]。基因被甲基化修饰后表达活性会受抑制，但也有少数促进的情况[4-5]。植物常通过动态调控甲基化修饰来调控基因的时空表达。基因组DNA的甲基化修饰、组蛋白的翻译后修饰以及其他表观遗传修饰可使一个基因组衍生出上百个转录组[6]。因此，DNA甲基化的调控机制是多年来遗传学领域研究的热点。

拟南芥因具有基因组小、遗传操作简单、生长周期短等优势，已成为研究植物甲基化调控的首选材料[7]。随着各种遗传筛选体系的不断发掘以及DNA甲基化测序技术的成熟，大量参与甲基化调控的基因被发现。截至目前，拟南芥基因组甲基化调控网络已基本清楚，但对调控DNA去甲基化机制了解很少。目前已知的DNA去甲基化有2种方式：被动和主动的去甲基化。被动去甲基化是DNA在复制过程中，与甲基化维持有关的酶功能丧失，造成新合成的DNA链被动丢失了甲基化信息[8-9]。而主动的DNA去甲基化是植物响应刺激(如外界逆境)主动地改变基因组甲基化修饰的模式，调节基因、转座元件等的表达活性。笔者综述了拟南芥中DNA主动去甲基化的研究进展，包括主动去甲基化的酶学过程、调控机制，主动去甲基化机制与RdDM(RNA dependent DNA methylation)机制的平衡，DNA去甲基化的研究方法及其生物学意义等，旨在为农作物的相关研究提供参考。

1DNA主动去甲基化的酶学过程

拟南芥DNA主动去甲基化采用碱基切除后再修复策略，即把原来甲基化的胞嘧啶切除，换成一个新的未被甲基化修饰的胞嘧啶。甲基化的胞嘧啶能被ROS1家族蛋白识别并切割。目前已知的ROS1家族蛋白包括ROS1、DME、DML2和DML3，体外生化试验表明它们是一类双功能糖苷酶[10-12]。它们首先切割碱基与糖基之间的C-N键释放甲基胞嘧啶，然后进一步切割DNA骨架。切割方式有β切割和β，δ切割2种，形成3′-PUA 或3′-P 2种产物[13]。3′-PUA产物优先生成，随后进一步转化为3′-P。3′端的PUA和磷酸基团会被APE1L和ZDP分别清除，形成3′-OH，后续DNA聚合酶和连接酶才能催化一个新的未被甲基化的胞嘧啶连接到切口处，从而完成DNA链的修复[14-15](图1)。承接最后修复任务的连接酶主要是AtLIG1，而聚合酶目前尚未被发现[16]。动物中的DNA主动去甲基化也以类似的过程进行，不同的是动物中胞嘧啶上的甲基要先被氧化成羧基，然后才能执行碱基的切除和修复[17]。

图1　拟南芥主动去甲基化的酶学过程Fig.1　Enzymatic process of active demethylation of Arabidopsis

2DNA主动去甲基化的调控机制

尽管拟南芥DNA主动去甲基化的酶学过程已较清楚，但植物是如何引导这些酶至需要去除甲基靶点的机制尚不清楚。近年来，一些新的去甲基化成员已被发现，组蛋白乙酰化酶IDM1被发现能识别去甲基化目标靶点的甲基，使H3K18和H3K23发生乙酰化，营造出一种宽松的染色质结构，方便ROS1执行去甲基化功能[18]；IDM2和IDM3是一类具有α晶体结构域的小热激蛋白，能与IDM1相互作用，起到维持IDM1正常功能的作用。以上3种蛋白构成一个复合体(IDM1复合体)，它们各自的突变会造成基因组上千个位点发生甲基化修饰的升高，且这些升高位点与ros1突变植株的甲基化升高位点有较高的重合。近年来研究发现CpG岛结合蛋白MBD7能与IDM1、IDM2和IDM3相互作用，是IDM1复合体的一个新成员。MBD7偏好与高度甲基化的、CG序列集中的DNA区域结合，因此推测MBD7可以牵引IDM1复合体到去甲基化靶点，进而创造宽松的染色质环境促使ROS1执行去甲基化功能[19-22]。IDM1复合体的发现使得人们意识到，特定基因组位点的表观修饰特征(包括DNA甲基化修饰和组蛋白的修饰)可能为去甲基化酶系统的到来提供了原始信号。

指引去甲基化酶系统到需要去除甲基特定位点的另一个可能机制被认为像RdDM通路一样，由非编码RNA进行介导。一种小RNA结合蛋白ROS3 的突变能导致基因组数千个甲基化位点发生变化，猜想ROS3可能结合去甲基化目标位点转录的小RNA，通过小RNA与目标位点的同源结合锚定在该位点上，并招募去甲基化酶系统到来[23]。

截至目前，尚未发现去甲基化关键酶ROS1与ROS3或IDM1复合体有直接的互作作用，也不能确定ROS1究竟是怎样被招募到去甲基化靶点上的[18，23]。体外生化试验表明，ROS1在切割完C-N键和DNA骨架后，会紧紧地结合在生成的底物上，这大大限制了ROS1作用的连续性[14-15](图2)。作用于ROS1下游的酶ZDP和APE1L均不能增加ROS1作用的连续性。ROS1不能长时间结合在DNA链上，这会严重干扰DNA的其他代谢活动。而且面对基因组繁重的去甲基化任务，ROS1在植物体内应该是连续性的。因此，是什么机制能确保ROS1作用的连续性需要继续探索。

图2　拟南芥DNA主动去甲基化的调控机制Fig.2　The regulatory mechanism of active demethylation in Arabidopsis

3主动去甲基化机制和RdDM 甲基化机制的平衡

植物主动去甲基化机制和RdDM甲基化机制作为相互对立的2种机制，它们是如何互相协作维持基因甲基化修饰的动态平衡尚不明确。研究发现，在RdDM突变植株中去甲基化关键酶ROS1的表达量被下调，这说明RdDM机制和主动去甲基化机制之间可能存在某种关联，协作维持基因甲基化修饰的动态平衡[24]。最新研究表明，ROS1基因启动子含有一个短TE序列，该TE序列甲基化程度可正向调控ROS1表达。与此同时，该TE序列也是RdDM机制和主动去甲基化机制作用的位点。染色质免疫共沉淀试验表明，RdDM机制的关键成员如NRPE1、AGO4在这段序列处均有富集，且这个位点是PollV转录产物sRNAs的结合位点，这2个证据直接表明该段TE序列是RdDM机制的一个活跃靶标。另一方面，ROS1突变也会导致该TE序列甲基化修饰上升，说明它是ROS1的一个靶标。综上所述，该段TE序列可以使RdDM机制和主动去甲基化机制相互“感知”对方的活跃程度[25-26]。当RdDM机制过度活跃时，该TE序列的甲基化修饰上升，促进了ROS1的表达，主动去甲基化机制也变得活跃起来，从而拮抗了RdDM机制。

4拟南芥DNA主动去甲基化的研究方法

拟南芥去甲基化调控相关的基因多数是通过各种遗传筛选方法发现的。去甲基化通路有几个很成功的遗传筛选体系，如RD29A-LUC体系：将一个内源启动子RD29A驱动的荧光素酶基因LUC转入拟南芥中，在低温、高盐等逆境下RD29A启动子被激活，转录出荧光素酶，当表达了荧光素酶的植株遇到荧光底物后就会发出荧光。将这一转基因植株进行EMS诱变，筛选出逆境刺激不再发出荧光的个体，并通过图位克隆找出相应的突变基因[27]。该筛选体系原本是用来筛选抗逆相关基因，然而却意外筛选到了植物中的第一个DNA去甲基化酶ROS1，随后还发现了ROS3和ROS5/IDM2。这些基因的突变都会导致启动子RD29A被高度甲基化，这种启动子的甲基化抑制了荧光素酶基因LUC的表达[11，22-23]。另一个成功的筛选体系是35S-SUCII体系：病毒来源的35S强启动子驱动一个蔗糖转运酶基因SUCII，携带这个转基因的拟南芥植株在蔗糖培养基中生长受到抑制，表现为根系不能伸长。利用这一转基因体系进行遗传筛选，筛选到了几乎全部的RdDM通路成员及很多的去甲基化新成员。这些成员的功能缺失均导致35S启动子的高度甲基化而引发了SUCII基因的转录沉默[25，28]。

去甲基化调控成员的功能缺失会导致基因组某些位点的甲基化修饰上升。基于此，人们发展了一种基于PCR的CHOP-PCR技术。该技术在基因组上寻找一些甲基化敏感的内切酶的酶切位点，并在该位点两侧设计PCR引物。当该位点因为去甲基化调控成员的突变而引起甲基化修饰上升时，内切酶将不能切割该位点，进行PCR反应时将会扩增出条带。利用该方法可以在各种突变体库中筛选可能参与去甲基化的新成员基因，IDM1和IDM2就是用这种方法筛选出来的[18，21]。近年来，基于第2代基因测序技术的全基因组甲基化测序技术被应用于甲基化调控研究。与CHOP-PCR只能分析个别基因组位点甲基化修饰变化情况相比，全基因组甲基化测序能观察到整个基因组的甲基化变化，但全基因组甲基化测序成本昂贵，且后续数据分析过程相对复杂。

酵母双杂交、烟草瞬时表达、IP-MS等方法常被用于研究去甲基化蛋白间的相互作用。拟南芥作为模式植物，已经构建出全部基因的单基因突变体库[29]。拟南芥还可以方便地进行杂交，能够把不同突变背景整合在一起。这些均为研究去甲基化基因间的互作提供了便利。

5DNA主动去甲基化的生物学意义

5.1去甲基化与转座元件活性研究表明，拟南芥基因组甲基化修饰主要发生在异染色质区域，包括着丝粒、端粒、重复序列和转座元件等[30-31]。拟南芥中的转座元件大多数是高度甲基化的，已有很多证据表明，当转座元件的甲基化修饰程度下降后，转座元件活性就会被激活。因此，拟南芥DNA主动去甲基化的一个重要生物学功能就是调控转座元件的活性。拟南芥的雌配子在形成过程中，中心细胞以及雌配子营养核的基因组会发生一轮全基因组范围内的去甲基化，这个过程会引起一些转座元件的激活[32-33]。

5.2去甲基化与基因印记拟南芥基因组中有少数成员，它们来自父本和母本的2个等位基因具有不同的表达活性，甚至有一方可能完全不表达[34]。这类印记基因的产生被认为是因为受精时父母本基因组具有不同的表观修饰状态，如甲基化修饰，因而造成受精后代中2个等位基因的表达活性不同[35]。在拟南芥等开花植物中，基因印记只出现在胚乳中[36]。因雌配子体中心细胞在成熟过程中要经历一轮全基因组范围的去甲基化，因此胚乳中父母本基因组的甲基化状态差异较大(父本高甲基化，母本低甲基化)，这是印记基因产生的遗传学原因[33]。研究发现，雌配子体中心细胞基因组甲基化下调程度很大的位点富含重复序列和转座元件，且很多是位于功能基因的侧翼。因此，认为基因印记产生可能是抑制转座元件时产生的副效应，即由于转座元件无意地插入某基因的调控区域而导致该基因的转录被抑制[37]。基于此，有人将中心细胞基因组甲基化修饰下调程度很大的区域进行了鉴定，成功发现了4个新的印记基因和约50个候选印记基因[38]。

研究发现，去甲基化酶DME是调控印记基因表达的重要分子，并只在雌配子体中心细胞中表达。直接参与中心细胞基因组的去甲基化，当精子和中心细胞结合后，DME终止表达。DME突变株是“母系致死”的，即种子中若来自母本的DME基因是有缺陷的，无论父本中的DME基因是否正常，种子均不能正常发育。这是因为母本DME缺陷使得中心细胞不能正常去甲基化，影响了印记基因的表达，中心细胞即使与正常的父本精子受精后也不能发育成正常的胚乳，种胚会因为得不到胚乳营养供给而死亡[10，39]。最新研究发现，去甲基化酶系统中除DME外，下游的ZDP和APE1L双突变，以及AtLIG1也能影响印记基因表达而出现母系致死现象[15-16]。

5.3去甲基化与植物抗逆研究发现，去甲基化酶ROS1、DML1和DML2三突变植株(rdd植株)对真菌感染的抵抗力下降。与野生型相比，rdd植株中大量基因表达量下调，表达量下调的基因中大部分与抗病性有关。进一步研究发现，表达量下调明显与抗病性有关的基因，它们在调控区域常含有一个短的重复序列或转座元件。这些短的重复序列或转座元件在rdd植株中其甲基化修饰被明显下调。因此，去甲基化的一个重要生物学功能被认为是通过调节抗逆基因调控区域的重复序列和转座元件的甲基化修饰来调控抗逆基因的表达[40]。

5.4去甲基化与果实成熟研究发现，DNA去甲基化与果实成熟进程有直接关联。在番茄中，一些促进果实成熟有关的基因如叶绿素降解基因、番茄红素基因等在果实成熟时其启动子要进行去甲基化，才能激活转录。当编码番茄DNA去甲基化糖苷酶的基因SlDMLs突变后，这些基因的启动子不能按时进行去甲基化，果实出现迟熟的表型[41-43]。类似的机制在苹果、梨等水果中也有所发现[44-45]。

6展望

作为遗传学领域最新研究热点，DNA主动去甲基化的研究在拟南芥上已取得一定进展，但仍有很多未知，如拟南芥如何响应内外环境刺激对基因组特定位点/基因进行去甲基化，以调节基因的表达活性；去甲基化与其他表观修饰之间的联系和协作，如DNA甲基化、组蛋白H3K9三甲基化、组蛋白变体H2A.Z 和H2A.W等都富集在异染色质区，但它们之间的联系和协助尚不清楚[6，46-47]。在性状应用上，利用DNA主动去甲基化等表观遗传手段进行作物改良的前景亟待开发。研究表明，番茄、苹果等果实的成熟依赖于果实成熟有关基因的去甲基化，应用表观修饰调控手段可能达到操纵果实成熟进程的目的[41]。另外，在植物抗逆方面，植物响应环境胁迫会大量地改变基因组的转录水平，这种改变一定程度上依赖于基因表观修饰状态的改变，如抗性基因启动子的去甲基化。近期研究表明，植物在逆境条件下获得的一部分表观遗传信息可以顺利传递给子代，使子代维持抗性。传统抗病作物的分子育种主要集中在通过抗性基因转录水平激活单基因功能，造成过多依赖于单基因功能，增强某种作物抗性品质同时破坏了对其他胁迫的抗性，并以降低作物的产量和品质为代价。而结合表观遗传学特性的新型育种则可能将亲代植物获得的系统性抗性稳定传递给子代，有效避免传统育种的缺陷。

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收稿日期2015-12-28

作者简介梁文洁(1990- )，女，山东威海人，硕士研究生，研究方向：植物甲基化和去甲基化功能。*通讯作者，副教授，博士，从事丹参雄性不育的分子机制研究。

基金项目国家自然科学基金项目(81373908)；陕西省自然科学基金项目(2015JM3092)；教育部高等学校博士学科点专项基金项目(20100204120027)。

中图分类号S 188

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)03-115-04